Phytomedicine I 靶向ANXA1！23-乙酰泽泻醇B改善LPS诱导的急性肺损伤

2026年8月20日，陆军军医大学新桥医院等研究团队在国际学术期刊《Phytomedicine》发表研究论文“Alisol B 23-acetate alleviates lipopolysaccharide-induced acute lung injury by targeting ANXA1 to modulate the ANXA1/FPR2-mediated MAPK/NF-κB signaling axis”。该研究发现，天然活性成分23-乙酰泽泻醇B（Alisol B 23-acetate，AB23-a）能够减轻脂多糖（LPS）诱导的急性肺损伤，并初步揭示了其通过ANXA1/FPR2介导的MAPK/NF-κB信号轴发挥抗炎作用的分子机制。

急性肺损伤（acute lung injury，ALI）的发生发展与过度炎症反应、巨噬细胞促炎性激活及肺泡结构破坏密切相关。目前，针对炎症损伤的有效药物仍有待进一步开发。23-乙酰泽泻醇B是中药泽泻中的天然三萜类活性成分，但其对急性肺损伤的作用及相关分子靶点尚未得到充分阐明。

研究首先采用BEAS-2B人支气管上皮细胞、RAW264.7小鼠巨噬细胞及小鼠肺类器官开展体外实验。结果显示，AB23-a能够降低IL-6、TNF-α等炎症相关指标，抑制巨噬细胞促炎性激活，并减轻肺类器官损伤。在LPS诱导的小鼠急性肺损伤模型中，AB23-a预处理进一步改善了肺组织水肿、炎症细胞浸润及病理损伤，并提高了部分肺功能指标。上述结果表明，AB23-a在多种实验模型中表现出一定的肺保护作用。

在作用机制方面，研究者利用有限蛋白水解结合质谱分析（LIP-MS）筛选出膜联蛋白A1（ANXA1）这一候选靶点。随后，通过分子对接、表面等离子体共振（SPR）、细胞热转移实验（CETSA）及DARTS实验，获得了AB23-a与ANXA1直接相互作用的证据，SPR测得的平衡解离常数（KD）为1.8 × 10⁻⁵ M。

进一步研究发现，AB23-a能够抑制MAPK相关分子ERK、JNK和p38的异常磷酸化，并减弱下游NF-κB炎症信号的激活。FPR2抑制剂WRW4能够部分削弱AB23-a的抗炎作用；ANXA1基因敲除同样降低了其对炎症信号的抑制效果，而恢复ANXA1表达后，相关调控作用得到恢复。这些结果支持ANXA1/FPR2介导的MAPK/NF-κB信号轴参与AB23-a的抗炎作用。

本研究的创新之处在于，将天然活性成分的肺保护表型与候选靶点结合、信号通路分析及基因功能验证相结合，为理解AB23-a的抗炎机制提供了较为系统的实验依据。

不过，该研究仍存在一定局限。首先，动物实验采用LPS刺激前给药的预防性干预方案，尚不能证明AB23-a对已发生的急性肺损伤具有治疗效果。其次，ANXA1与AB23-a的结合亲和力有限，且部分保护作用在ANXA1缺失或FPR2抑制后仍然存在，提示可能还有其他作用靶点。此外，研究尚未系统开展药代动力学和毒理学评价，ANXA1与FPR2之间的具体信号传递过程也有待进一步验证。因此，未来仍需通过治疗性给药实验、深入的靶点机制研究及系统安全性评价，明确AB23-a的临床转化潜力。

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【摘 要】

背景（Background）：急性肺损伤（acute lung injury，ALI）是一种具有较高发病率和死亡率的常见呼吸系统疾病，对公共卫生构成严重威胁。除机械通气外，目前临床上可用的安全有效治疗手段仍然有限。23-乙酰泽泻醇B（Alisol B 23-acetate，AB23-a）是中药泽泻的主要生物活性成分之一，具有改善多种炎症性疾病的潜力，但其在脂多糖（LPS）诱导的急性肺损伤中的作用尚未见报道。

目的（Purpose）：本研究旨在探讨AB23-a能否改善急性肺损伤，并明确其发挥保护作用的潜在机制。

研究设计（Study design）：本研究采用LPS诱导的BEAS-2B细胞、RAW264.7巨噬细胞、小鼠肺类器官（MLOs）及LPS诱导的小鼠急性肺损伤模型作为实验体系。研究者采用不同浓度的AB23-a处理细胞和动物，通过功能实验评估炎症反应及巨噬细胞极化情况，并利用FPR2抑制、ANXA1基因敲除及恢复实验，验证相关靶点的参与及受体依赖性下游信号传导。

方法（Methods）：采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和Western blot检测炎症介质以及ANXA1/FPR2介导的MAPK/NF-κB信号通路关键分子的mRNA和蛋白表达水平。采用免疫荧光技术评价细胞表型，并通过表面等离子体共振（SPR）和细胞热转移实验（CETSA）验证AB23-a与ANXA1之间的直接结合。

结果（Results）：研究发现，AB23-a能够减轻LPS诱导的炎症反应。例如，在LPS刺激的RAW264.7细胞中，IL-6水平由3460.89 ± 150.76 pg/mL降至320.00 ± 106.82 pg/mL，同时AB23-a能够抑制M1型巨噬细胞极化。在肺组织中，AB23-a减少了CD86阳性巨噬细胞浸润，并改善了小鼠呼吸功能。肺损伤评分由0.98 ± 0.04降至0.32 ± 0.12，呼气峰流量（PEF）由1.97 ± 0.20 mL/s升至5.48 ± 0.25 mL/s。在机制方面，SPR实验测得AB23-a与ANXA1的平衡解离常数（KD）为1.8 × 10⁻⁵ M，结合后续验证实验，结果表明AB23-a能够直接结合ANXA1，并抑制MAPK和NF-κB信号通路的过度激活。

结论（Conclusion）：本研究证实，AB23-a在LPS诱导的急性肺损伤模型中具有预防性保护作用，并确定ANXA1是参与其发挥保护作用的重要功能介质。

01

研究背景及科学问题

一、研究背景

急性肺损伤（acute lung injury，ALI）是一种以肺部过度炎症反应、肺泡结构破坏及呼吸功能障碍为主要特征的疾病。目前，临床治疗仍以呼吸支持为主，安全有效的药物干预手段相对有限。

23-乙酰泽泻醇B（Alisol B 23-acetate，AB23-a）是中药泽泻中的天然三萜类活性成分，具有一定的抗炎活性，但其能否改善LPS诱导的急性肺损伤，以及发挥作用的关键分子靶点和信号机制，尚不明确。

膜联蛋白A1（ANXA1）是参与炎症调控的重要蛋白，可通过相关受体及下游信号通路影响炎症反应。因此，探究AB23-a与ANXA1之间的作用关系，并明确其对炎症信号网络的调控机制，有助于进一步认识天然活性成分改善急性肺损伤的药理基础。

二、科学问题

1. AB23-a能否改善急性肺损伤？明确其对炎症因子表达、巨噬细胞促炎性激活、肺组织病理损伤及呼吸功能的影响。

2. ANXA1是否是AB23-a发挥抗炎作用的重要靶点？验证两者是否存在直接相互作用，并明确ANXA1在AB23-a保护效应中的功能贡献。

3. AB23-a通过何种信号机制发挥肺保护作用？阐明ANXA1/FPR2介导的MAPK/NF-κB信号轴在抑制炎症反应中的作用，并明确该通路对AB23-a保护效应的贡献。

核心科学问题：AB23-a是否通过靶向ANXA1，调控FPR2介导的MAPK/NF-κB信号通路，从而抑制过度炎症反应并减轻LPS诱导的急性肺损伤？

02

重要发现及亮点

1. AB23-a能够显著抑制LPS诱导的肺上皮细胞炎症反应

研究首先采用LPS刺激BEAS-2B人支气管上皮细胞，评价23-乙酰泽泻醇B（AB23-a）的抗炎作用，并通过CCK-8实验筛选合适的干预浓度。

结果显示，LPS刺激显著上调IL-1β、IL-6、IL-8和CCL2等炎症相关基因的表达，而AB23-a预处理能够明显抑制上述变化。Western blot结果进一步显示，AB23-a降低了COX2、IL-8和CCL2等炎症相关蛋白的表达，支持其对LPS诱导的肺上皮细胞炎症反应具有抑制作用。

上述结果表明，AB23-a能够减轻LPS诱导的肺上皮细胞炎症反应，为进一步研究其在急性肺损伤中的保护作用提供了依据。

图1：AB23-a对LPS诱导的肺上皮细胞炎症反应的抑制作用。

（A）AB23-a的化学结构；（B–D）不同浓度AB23-a对BEAS-2B细胞、RAW264.7细胞及小鼠肺类器官（MLOs）活力的影响，采用CCK-8法检测；（E–H）qPCR检测IL-1β、IL-6、IL-8和CCL2的相对mRNA表达水平；（I）Western blot检测BEAS-2B细胞中COX2、IL-8和CCL2的蛋白表达水平。

实验至少进行3次生物学重复，数据以均值±标准差表示，采用单因素方差分析。ns表示差异无统计学意义；*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

2. AB23-a抑制巨噬细胞促炎性激活，降低炎症介质释放

为进一步评价AB23-a对免疫细胞炎症反应的影响，研究者采用LPS刺激RAW264.7小鼠巨噬细胞，并检测细胞形态、NO释放、ROS生成及炎症因子表达。

结果显示，LPS刺激导致巨噬细胞形态发生明显改变，同时促进NO释放和ROS生成。AB23-a预处理能够减轻上述变化，并降低IL-6、TNF-α、COX2和CCL2等炎症相关指标的表达。ELISA和Western blot结果进一步支持其对炎症介质产生的抑制作用。

这些结果提示，AB23-a不仅能够抑制肺上皮细胞炎症反应，还能够调节巨噬细胞的促炎性激活状态。

图2：AB23-a抑制LPS诱导的巨噬细胞促炎性激活。

（A）RAW264.7细胞的代表性明场图像；（B）不同处理组细胞培养上清中的NO水平；（C）采用DCFH-DA荧光强度定量分析不同处理组的ROS生成水平；（D–G）qPCR检测IL-6、TNF-α、COX2和CCL2的相对mRNA表达水平；（H、I）ELISA检测细胞培养上清中的IL-6和TNF-α浓度；（J）Western blot检测TNF-α和COX2的蛋白表达水平。

实验至少进行3次生物学重复，数据以均值±标准差表示，采用单因素方差分析。ns表示差异无统计学意义；*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

3. AB23-a减轻肺类器官损伤，改善炎症微环境下的组织样结构

为提高体外实验对肺组织复杂结构的模拟能力，研究者进一步建立小鼠肺类器官模型，并将其与RAW264.7巨噬细胞共培养，观察AB23-a对炎症相关损伤的影响。

结果显示，小鼠肺类器官具有一定的三维组织结构，并包含纤毛细胞、杯状细胞、AT2细胞、club细胞和基底细胞等肺部细胞类型。LPS刺激后，类器官炎症因子表达升高；在类器官与巨噬细胞共培养体系中，炎症刺激还导致类器官生长受抑、结构损伤及存活率下降。AB23-a预处理能够降低炎症相关指标的表达，改善类器官存活情况，并减轻巨噬细胞对类器官的损伤。

上述结果表明，AB23-a的保护作用不仅体现在单一细胞水平，还能够在肺类器官模型中得到验证。

图3：AB23-a减轻LPS诱导的小鼠肺类器官损伤。

（A）肺类器官的HE染色图像；（B）肺类器官与RAW264.7细胞共培养体系中类器官的存活率；（C）肺类器官多重免疫荧光代表性图像：α-tubulin标记纤毛细胞（洋红色），MUC5AC标记杯状细胞（红色），SFTPC标记AT2细胞（黄色），CC10标记club细胞（绿色），KRT5标记基底细胞（亮蓝色），DAPI标记细胞核（蓝色）；（D）肺类器官与RAW264.7细胞共培养体系的明场图像；（E、F）qPCR检测IL-1β和IL-6的相对mRNA表达水平；（G）ELISA检测细胞培养上清中的IL-6浓度。

实验至少进行3次生物学重复，数据以均值±标准差表示，采用单因素方差分析。ns表示差异无统计学意义；*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

4. AB23-a改善小鼠急性肺损伤及呼吸功能障碍

在体内实验中，研究者采用LPS气管内滴注建立小鼠急性肺损伤模型，并在LPS刺激前给予AB23-a干预，从肺组织病理、肺水肿及呼吸功能等方面评价其保护作用。

结果显示，LPS刺激导致肺组织明显肿大、水肿及出血，肺湿干重比升高，HE染色可见肺泡间隔增厚、炎症细胞浸润及出血等病理变化。AB23-a预处理能够减轻上述损伤，并改善潮气量、分钟通气量、呼气峰流量及呼气流量等肺功能指标。

进一步研究发现，AB23-a能够降低肺组织中CD86阳性免疫细胞的浸润，并减少F4/80与CD86的共定位，同时降低肺组织及支气管肺泡灌洗液中的炎症介质水平。

这些结果从整体动物水平支持了AB23-a对LPS诱导的急性肺损伤具有保护作用。

图4：AB23-a对LPS诱导的小鼠急性肺损伤的保护作用。

（A）体内实验设计示意图；（B）各处理组小鼠肺组织的代表性外观图像；（C）肺组织湿重与干重比值；（D）肺组织HE染色代表性图像；（E–H）肺功能指标，包括潮气量（TV）、分钟通气量（MV）、呼气峰流量（PEF）及用力肺活量呼出50%时的呼气流量（EF50）。

实验至少进行3次生物学重复，数据以均值±标准差表示，采用单因素方差分析。ns表示差异无统计学意义；*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

图5：AB23-a抑制肺组织炎症细胞浸润及炎症介质表达。

（A）肺组织多重免疫荧光染色代表性图像；（B、C）定量分析M1型巨噬细胞极化比例及CD86阳性免疫细胞的总体浸润率；（D、E）ELISA检测支气管肺泡灌洗液（BALF）中的IL-1β和IL-6浓度；（F）Western blot检测肺组织中IL-1β、IL-6和iNOS的蛋白表达水平。

实验至少进行3次生物学重复，数据以均值±标准差表示，采用单因素方差分析。ns表示差异无统计学意义；*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

5. AB23-a直接结合ANXA1，研究初步明确其关键作用靶点

为揭示AB23-a发挥抗炎作用的分子基础，研究者采用有限蛋白水解结合质谱分析（LIP-MS）筛选潜在作用靶点，并发现膜联蛋白A1（ANXA1）是值得进一步研究的候选蛋白。

分子对接结果显示，AB23-a与ANXA1具有潜在结合能力，预测结合能为−8.8 kcal/mol。随后，表面等离子体共振（SPR）实验进一步证实两者存在直接相互作用，平衡解离常数（KD）为1.8 × 10⁻⁵ M。细胞热转移实验（CETSA）显示，AB23-a处理后ANXA1的热稳定性提高，其熔解温度由57.89 ℃升至61.39 ℃；DARTS实验也显示ANXA1对蛋白酶降解的抵抗能力增强。

分子动力学模拟及丙氨酸扫描分析进一步提示，ARG234、PHE192和VAL194可能参与AB23-a与ANXA1的相互作用。

上述结果通过多种实验方法支持了AB23-a与ANXA1之间的直接结合，为进一步验证ANXA1在其抗炎作用中的功能提供了依据。

图6：AB23-a能够直接结合ANXA1蛋白。

（A）LIP-MS实验流程示意图；（B）LIP-MS鉴定得到的ANXA1肽段；（C、D）AB23-a与ANXA1复合物的代表性结合构象；（E、F）采用SPR验证ANXA1与AB23-a之间的相互作用；（G–I）分子动力学模拟计算得到的均方根偏差（RMSD）、回转半径（Rg）及均方根波动（RMSF）；（J）BEAS-2B细胞中ANXA1的热稳定性分析，对照组和AB23-a处理组的熔解温度（Tm）分别为57.89 ℃和61.39 ℃；（K）BEAS-2B细胞中ANXA1蛋白在有无AB23-a处理条件下的蛋白酶降解抵抗能力；（L）AB23-a与ANXA1复合物的丙氨酸扫描突变分析（ASM）。

6. AB23-a通过ANXA1/FPR2相关信号轴调控MAPK/NF-κB炎症通路

在明确ANXA1为AB23-a的重要结合靶点后，研究者进一步检测MAPK/NF-κB信号通路的变化，并采用FPR2抑制剂WRW4分析相关受体信号的作用。

结果显示，AB23-a能够抑制LPS诱导的ERK、JNK和p38等MAPK信号分子的异常磷酸化，并减弱下游NF-κB炎症信号的激活。同时，WRW4处理能够部分逆转AB23-a对相关信号通路、巨噬细胞促炎性激活及炎症因子表达的抑制作用，提示FPR2参与其抗炎效应。

为进一步验证ANXA1的功能，研究者采用CRISPR/Cas9技术敲除ANXA1。结果显示，ANXA1缺失后，AB23-a对MAPK/NF-κB信号及下游炎症指标的抑制作用明显减弱；在ANXA1敲除细胞中恢复ANXA1表达后，相关调控作用得到恢复。

这些结果支持ANXA1/FPR2相关信号轴参与AB23-a的抗炎作用，但其完整的细胞内外信号传递过程仍需进一步验证。

图7：AB23-a通过调控ANXA1/FPR2信号轴发挥抗炎作用。

（A–C）Western blot检测BEAS-2B细胞、RAW264.7细胞及小鼠肺类器官中MAPK和NF-κB信号通路关键分子的表达及活化情况；（D）Western blot检测RAW264.7细胞中MAPK、NF-κB通路关键分子及下游促炎因子的表达；（E）RAW264.7细胞的代表性明场图像；（F–I）qPCR检测RAW264.7细胞中IL-6、TNF-α、COX2和CCL2的相对mRNA表达水平；（J、K）ELISA检测RAW264.7细胞培养上清中的IL-6和TNF-α浓度。

实验采用3次生物学重复，数据以均值±标准差表示，采用单因素方差分析。ns表示差异无统计学意义；*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

图8：通过ANXA1基因敲除及功能恢复实验验证其在AB23-a抗炎作用中的贡献。

（A、B）Western blot验证BEAS-2B细胞和RAW264.7细胞中ANXA1的敲除效率；（C、D）Western blot检测ANXA1缺失条件下MAPK和NF-κB信号通路关键分子的变化；（E–L）qPCR检测BEAS-2B细胞和RAW264.7细胞中炎症相关因子的相对mRNA表达水平。

实验采用3次生物学重复，数据以均值±标准差表示，采用单因素方差分析。ns表示差异无统计学意义；*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

7. 提出AB23-a通过ANXA1/FPR2/MAPK/NF-κB轴改善急性肺损伤的机制模型

综合靶点结合、信号通路检测、受体抑制及基因敲除恢复实验，研究者提出了AB23-a改善急性肺损伤的工作模型：AB23-a与细胞内ANXA1直接结合，可能促进ANXA1稳定并影响其相关信号功能；ANXA1释放至细胞外后，可与细胞膜上的FPR2相互作用，进而抑制LPS诱导的MAPK/NF-κB炎症信号，最终减轻炎症介质释放及肺组织损伤。

需要注意的是，研究尚未直接证明AB23-a促进ANXA1分泌或ANXA1与FPR2形成复合物，因此该信号传递模型仍属于有实验依据的工作假说。

图9：AB23-a通过ANXA1/FPR2信号轴改善LPS诱导的急性肺损伤的机制示意图。

AB23-a直接结合细胞内ANXA1；ANXA1分泌至细胞外后与细胞膜上的FPR2相互作用，该信号轴抑制LPS诱导的MAPK/NF-κB炎症通路。FPR2拮抗剂WRW4可阻断其下游信号调控。

研究亮点总结

本研究从肺上皮细胞、巨噬细胞、肺类器官到小鼠急性肺损伤模型，系统评价了AB23-a的抗炎及肺保护作用；通过LIP-MS、SPR、CETSA、DARTS及ANXA1基因敲除和恢复实验，进一步支持ANXA1是其重要作用靶点，并提出ANXA1/FPR2介导的MAPK/NF-κB信号轴参与其抗炎效应，为天然活性成分干预炎症性肺损伤提供了新的实验依据。

【贡献】★★★★★

本研究系统揭示了天然酚酸类化合物藜芦酸（VA）改善代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MAFLD）的潜在作用机制，证实VA能够减轻高脂饮食诱导的肥胖、胰岛素抵抗及肝脏脂质沉积，并通过促进脂肪酸β氧化、脂解及改善线粒体呼吸功能，调节机体糖脂代谢稳态。研究进一步结合网络药理学、分子对接、DARTS、CETSA及基因敲低实验，发现PPARG是VA发挥降脂作用的重要候选靶点，为阐明其分子作用机制提供了实验依据。该研究从整体代谢调控、细胞脂质代谢及分子靶点等多个层面拓展了对VA生物学活性的认识，为天然活性化合物干预MAFLD及开发潜在治疗策略提供了新的研究思路。

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