什么是液相色谱中“体积”？

大家在阅读液相色谱的文章的时候，经常能够看到各种名字的“体积”，比如死体积、驻留体积、延迟体积、孔隙体积等等，这些“体积”到底都是些什么东西？它们对我的液相分析到底意味着什么呢？今天我们就看一看经常用到的这三个体积

指的是有效进样点到有效检测点之间排除色谱柱中包含固定相部分的体积。包括 4 部分：进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相颗粒间隙（被流动相占据， Vm ）、柱出口管路体积、检测器流动池体积。其中只有 Vm 参与色谱平衡过程，其他3部分只起峰扩展作用。为防止峰扩展，这3部分体积应尽量减小。

系统死体积一般通过进样基本不保留的小分子来测定。尿嘧啶、丙酮和硫脲是反相色谱中最常用的测试物质；死时间与死体积相关；可以用死体积除以流速测定。

▉ 死体积计算

对于HPLC来说，该如何计算死体积呢。

死体积(dead volume,V0)——由进样器进样口到检测器流动池未被固定相所占据的空间。它包括4部分：进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相颗粒间隙（被流动相占据，Vm）、柱出口管路体积、检测器流动池体积。其中只有Vm参与色谱平衡过程，其它3部分只起峰扩展作用。为防止峰扩展，这3部分体积应尽量减小。

死时间(dead time,t0)——不保留组分的保留时间。即流动相（溶剂）通过色谱柱的时间。

测量系统死体积通常需要通过实验进行测量，常用方法是通过进一针和色谱柱固定相没有任何作用的特殊溶液时，就会得到一个色谱峰，由此峰可以测得死时间（t0），这就是t0的实测结果。

然后通过计算得到系统死体积:

死体积（V0) = 死时间t0×流动相的流速F。

▉ 减少死体积

在我们使用或维护的过程中，如果涉及管路等配件的更换，应该选择与原规格一致的配件，以确保死体积与原来一致，避免死体积的增加而带来峰形的展宽。

接装色谱柱时，需确保管线接头匹配完好（特别注意peek管接头的使用，以及管线与色谱柱的连接处）避免形成接头空腔（如下图）

▉那什么时候应选择哪种接头？

PEEK 和聚酮接头尤为适用于需要经常更换的连接，或需要生物兼容性时。也在对压力要求不高时使用，如色谱柱的出口接头。PEEK 接头的最高使用压力为 200 bar，聚酮接头为 600 bar。

▉驻留体积的定义

驻留体积是指溶剂首次混合点（通常在液相色谱仪的混合腔内或比例阀中）与液相色谱柱头之间的体积。其中，低压混合系统的驻留体积等于从比例阀经泵和其他系统组件到柱头的体积总和。高压混合系统的驻留体积等于从溶剂首次混合点，经过两个计量泵再到柱头的体积总和。

在等度分离中，驻留体积对保留时间没有任何影响，而在梯度分离中则会造成重大影响。若不了解系统的驻留体积，可能会带来严重影响，因为驻留体积有可能远大于色谱柱体积。

▉相同色谱柱，不同仪器

若想在不同仪器上使用相同尺寸的色谱柱，往往需要考虑驻留体积这个问题，因为不同驻留体积的仪器使用同一方法也可能影响分析结果。在柱头开始梯度洗脱时，需要确保通过色谱柱的流动相体积相同。如果流动相的体积不相同，结果也将不同。

若在两个实验室内对不同驻留体积的 HPLC 仪器使用相同的方法，运行结果很可能不完全相同，因为两种（或多种）流动相混合形成梯度后，将在各个仪器的流路内经过一段不同的时间后方能到达柱头。因此，进样后受时间影响，分析物将通过不同的流动相组分，其保留时间和分离度也会受到影响。如果将梯度方法从一台仪器转移到另一台仪器，保留时间会根据两个系统的驻留体积发生变化。流路体积越接近，结果的一致性越高。

结果如有差异，可采用多种方法加以纠正。若仪器的驻留体积较小，可以通过增加仪器的体积来调节驻留体积；若仪器的驻留体积较大，可以减小仪器连接管线的内径和长度。此外，还可以在该方法中设置梯度延迟，以补偿流路系统中的不同驻留时间。

▉ 延迟体积

延迟体积指的是溶剂混合点（通常在液相色谱仪的混合腔内或比例阀中）与 LC 柱头之间的体积。

在梯度洗脱或等度洗脱的溶剂组成改变时，延迟体积对于使色谱柱在尽可能短的时间内完成流动相组成的变化非常重要。低压混合物系统的驻留体积一般比高压混合系统大。

▉ 减少延迟体积

由于不同仪器的延迟体积不同，在运行梯度方法时，可能会对分离度及保留时间造成影响，并进一步可能会对方法转移或验证造成影响。

延迟体积越大，可能造成的影响越大。越大的延迟体积，改变梯度比例后到达色谱柱的时间就越长，尤其是在低流速下。

减小不同滞留体积对分离效果影响的办法主要有三种：

• 第一（最好的），某些系统控制器可以在梯度开始后的精确时间进样。如延迟进样时间tD，梯度和样品可同时到达柱进口。
• 第二，如梯度过程开始可插入一段等度过程，用VD值较大的系统时则可以缩短这一过程；而用VD值较小的系统时则可延长这一过程。以此方式，样品和梯度则会同时达到柱进口。
• 第三，以一较陡梯度从5%B至初始%B开始。