J Ethnopharmacol｜活细胞“钓”出柴归汤GPER候选配体：16α-HTA与泽泻醇A获CETSA验证并抑制AKT磷酸化！（朱红俊/郭林秀 —...

2026年7月2日，南京中医药大学无锡附属医院（无锡市中医医院）朱红俊团队与河南农业大学郭林秀团队等，在《Journal of Ethnopharmacology》（JCR Q1，最新Impact Factor=6.8）在线发表题为“A cell-based affinity mass spectrometry strategy for the rapid discovery of active components from Chinese herbal formulae: Chai-Gui decoction as a study case”的研究论文。该文于2026年1月23日投稿，6月9日修回，6月26日接收。

中药复方含有大量结构和性质各异的天然产物，如何从复杂体系中快速筛选能够直接结合特定靶蛋白的活性成分，是中药药效物质基础研究中的重要难题。该研究以柴归汤（CGD）和G蛋白偶联雌激素受体（GPER）为例，建立了一套基于活细胞的亲和质谱筛选流程：先让柴归汤成分在完整细胞环境中与GPER结合，再提取细胞膜、洗脱结合成分，并通过超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UPLC-QTOF/MS）进行鉴定。

研究人员从GPER过表达细胞中捕获了10种柴归汤成分，其中7种仅在GPER过表达细胞中被检测到。分子对接进一步筛选出16α-羟基松苓酸（16α-HTA）和泽泻醇A（Alisol A）两种优先候选化合物。细胞热迁移分析（CETSA）证实，两者能够提高GPER的热稳定性，支持其与GPER直接结合。随后开展的MDA-MB-231细胞实验显示，低剂量16α-HTA和泽泻醇A可下调GPER蛋白表达，并在表皮生长因子受体（EGFR）未明显改变的情况下抑制AKT磷酸化。

该研究的重点并非证明柴归汤或上述单体成分具有临床疗效，而是建立一套将活细胞配体捕获、质谱鉴定、分子对接、靶点结合验证和细胞功能评价相结合的筛选策略，为从复杂中药复方中发现靶蛋白配体提供了新的技术路径。

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【摘 要】

民族药理学意义：中药复方由多种天然产物组成，是发现新型药物的重要资源。然而，其化学组成十分复杂，给生物活性成分的鉴定带来了显著挑战。柴归汤（Chai-Gui Decoction，CGD）由两首常用于妇科疾病治疗的经典方剂组合而成，但其活性成分尚未得到系统鉴定。

研究目的：本研究旨在建立一种基于细胞的亲和质谱策略，用于从复杂中药复方中快速发现活性成分。研究以柴归汤为例，选择G蛋白偶联雌激素受体（G protein-coupled estrogen receptor，GPER）作为目标蛋白。

材料与方法：研究人员建立了稳定过表达GPER-1的人胚肾293T细胞系（HEK293-T），并将其与柴归汤提取物共同孵育，以筛选可能与GPER结合的配体。随后收集细胞膜碎片，分离与受体结合的成分，并采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UPLC-QTOF/MS）进行鉴定。通过分子对接计算所捕获配体与GPER的理论结合亲和力；对预测亲和力最高的化合物进一步采用细胞热迁移分析（CETSA）验证其靶点结合能力，并通过细胞实验评价其生物学活性。

结果：研究建立了一种新的配体捕获方法，将活细胞内的配体-受体结合、细胞膜提取与裂解以及液相色谱-质谱鉴定整合在同一流程中。与对照细胞相比，柴归汤提取物中的7种化合物在GPER过表达细胞中呈现选择性检出。分子对接结果进一步提示，这些化合物与GPER蛋白具有一定结合潜力。

其中，预测结合亲和力最高的两种成分——16α-羟基松苓酸（16α-hydroxytrametenolic acid，16α-HTA）和泽泻醇A（Alisol A）——均可在CETSA实验中改变GPER的热稳定性，支持二者能够与GPER结合。后续细胞实验显示，低剂量16α-HTA和泽泻醇A可降低GPER蛋白表达，并以不依赖EGFR变化的方式抑制AKT磷酸化。

结论：本研究提出了一套可行的整合策略，将细胞提取、UPLC-QTOF/MS分析、分子对接模拟、CETSA和细胞功能实验相结合，可用于从复杂混合物中有效发现并验证特定蛋白靶点的候选配体。

01

研究背景及科学问题

天然产物（natural products，NPs）及其衍生物构成了发现新型治疗药物的重要化合物资源库。已有统计显示，美国食品药品监督管理局（FDA）批准的小分子药物中，有63.1%直接或间接来源于天然产物，或其结构设计受到天然产物骨架的启发。

中药及其复杂复方是天然药物资源库中的重要组成部分，在数千年的应用过程中产生了青蒿素、奎宁和喜树碱等具有代表性的活性化合物。中药复方的突出特点之一是成分复杂，这些成分可能同时作用于多个生物靶点和信号通路，并产生协同效应。因此，从复杂中药体系中筛选并验证关键活性成分，是药理学研究中具有重要意义和药物发现潜力的方向。

柴归汤（CGD）是一种由小柴胡汤和当归芍药散组合而成的复方。两首基础方均源于约两千年前的中医经典《伤寒杂病论》，并长期用于妇科疾病。

小柴胡汤可用于感染过程伴高热和精神状态改变所引起的妇科症状，与中医所称的“热入血室”证候相对应。当归芍药散则是缓解妇科疾病相关女性腹痛的代表方剂。柴归汤由日本学者Yumo组方，随后由中国学者Huang命名，目前已用于多种妇科及围绝经期相关疾病，包括多囊卵巢综合征、痛经，以及失眠、高血压、头痛和眩晕等围绝经期症状。

基于上述理论，作者团队长期将柴归汤用于女性围绝经期高血压的治疗，并观察到较好的治疗效果。柴归汤的降压作用也曾在自发性高血压大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHRs）中得到验证；在同一动物实验中，柴归汤还可上调G蛋白偶联雌激素受体（GPER）的表达。

围绝经期雌激素水平下降可影响血管功能、代谢和神经内分泌调节等多个系统，是这一阶段血压升高的病理生理基础，也是围绝经期高血压的重要危险因素之一。

GPER是雌激素发挥作用的关键靶点之一，属于七次跨膜蛋白，主要定位于多种细胞的胞内膜结构。GPER广泛表达于哺乳动物的动脉壁和心脏，可参与血压调节。激活GPER能够通过直接作用于血管平滑肌，以及激活内皮细胞L-精氨酸-NOS3-NO-cGMP通路等机制，引起急性血管舒张。急性或慢性给予GPER激动剂G-1均可诱导血管舒张和降低血压，这种作用与一氧化氮释放和抗氧化效应有关。

目前，研究人员已经开发并鉴定出多种具有较高选择性的GPER配体，包括激动剂和拮抗剂。最早报道的GPER选择性配体G-1是通过化合物库筛选发现的。此后还发现了GPERL-2等激动剂，以及G15、G36、G36的无环类似物CIMBA和MIBE等拮抗剂。在论文发表时，这些选择性GPER配体中仅G-1，即LNS8801，进入了临床试验阶段。

GPER高效配体发现困难可能与多种因素有关，包括膜蛋白稳定性较低、缺乏GPER晶体结构、内源性配体信息不足，以及缺少高效的配体筛选方法。现有配体发现方法主要包括基于结构的虚拟筛选、基于细胞表型的筛选，以及基于固定化靶蛋白的筛选。

这些方法可能存在筛选效率较低，或所获得配体的功能难以在活细胞环境中重现等问题。因此，直接在活细胞中识别GPER配体，可能有助于提高候选化合物后续转化的可能性。

本研究建立了一种基于细胞的亲和质谱策略，以从柴归汤中快速发现潜在的选择性GPER配体，并重点筛选具有较高结合亲和力的候选成分。

研究人员首先将柴归汤提取物与稳定过表达GPER-1的人胚肾细胞共同孵育，随后分离携带结合成分的细胞膜组分，洗脱并采用UPLC-QTOF/MS鉴定被捕获的化合物，同时与对照细胞中的成分丰度进行比较。

研究进一步通过分子对接模拟计算候选配体与GPER的理论结合亲和力，采用CETSA验证候选化合物与靶蛋白之间的直接物理相互作用，并在乳腺癌细胞模型中评价排名前两位的候选成分16α-HTA和泽泻醇A对GPER蛋白表达及AKT磷酸化水平的影响。

02

重要发现及亮点

基于活细胞亲和质谱从柴归汤中捕获GPER候选配体

研究人员首先通过质粒构建、病毒包装和转导，建立了稳定过表达GPER-1的HEK293-T细胞系，作为活细胞配体筛选模型。对照细胞为稳定转染不含GPER-1基因空载体的HEK293-T细胞，即HEK293T-NC细胞。

定量PCR结果显示，与HEK293T-NC细胞相比，HEK293T-GPER1细胞中的GPER-1 mRNA表达升高约2000倍。荧光显微镜观察也证实，HEK293T-GPER1细胞具有良好的细胞活性和转导效率，表明GPER-1过表达细胞系构建成功。

随后，研究人员将柴归汤提取物与细胞共同孵育，收集细胞膜组分并洗脱与细胞结合的化合物，再采用UPLC-QTOF/MS进行检测。按照“必须能够在GPER-1过表达细胞裂解物中检出”的第一轮筛选标准，共有10种化合物进入候选成分库。其中9种在负离子模式下检出，1种在正离子模式下检出。

研究人员根据化合物的精确质量和保留时间，与标准品或数据库信息进行匹配，最终鉴定出以下10种候选成分：白芍内酯苷（Albiflorin）、芍药苷（Paeoniflorin）、二氢灯盏花乙素（Dihydroscutellarin）、鞣花酸（Ellagic acid）、二氢黄芩苷（Dihydrobaicalin）、千层纸素A葡萄糖醛酸苷（Oroxylin A glucuronide/Wogonoside）、柴胡皂苷A（Saikosaponin A）、2″-O-乙酰基柴胡皂苷A、16α-羟基松苓酸以及泽泻醇A。

图1：采用活细胞结合与UPLC-QTOF/MS分析，从柴归汤提取物中筛选可能与GPER结合的候选化合物。（a、b）柴归汤粗提物中10种可被细胞膜捕获成分的提取离子色谱图（extracted ion chromatograms，EIC），分别在负离子模式（a）和正离子模式（b）下采集。（c、d）不同细胞系细胞膜裂解物的EIC图，分别在负离子模式（c）和正离子模式（d）下采集。（e）符合“能够在GPER-1过表达细胞裂解物中被检测到”这一筛选标准的10种候选成分的化学结构。色谱图中的红线代表空白细胞培养基，粉红线代表野生型HEK293T-NC细胞，蓝线代表GPER-1过表达的HEK293T-GPER1细胞。ESI−表示负电喷雾离子化模式；ESI+表示正电喷雾离子化模式。

研究人员进一步比较了10种成分在GPER-1过表达细胞和野生型细胞中的丰度。首先分别测定每种成分在两类HEK293-T细胞中的色谱峰面积，再以样品总蛋白浓度进行归一化，以减少上样细胞数量差异带来的影响。

结果显示，白芍内酯苷、芍药苷和千层纸素A葡萄糖醛酸苷可同时在GPER-1过表达细胞和野生型HEK293T细胞的细胞膜裂解物中检出。

相比之下，另外7种化合物仅在GPER-1过表达细胞中被检测到，而在野生型HEK293T细胞中未被检出，包括二氢灯盏花乙素、鞣花酸、二氢黄芩苷、柴胡皂苷A、2″-O-乙酰基柴胡皂苷A、16α-羟基松苓酸和泽泻醇A。研究人员据此将这7种成分定义为柴归汤中潜在的GPER候选配体。

图2：通过比较HEK293T-GPER1细胞和野生型HEK293T-NC细胞中的色谱峰面积，筛选柴归汤提取物中的GPER候选配体。（a）10种候选成分的提取离子色谱峰。（b）HEK293T-GPER1细胞裂解物与HEK293T-NC对照细胞裂解物中10种已鉴定化合物的相对丰度；数据均以样品总蛋白浓度进行归一化。数据以均值±标准差表示，每组n=3。统计学显著性采用Mann-Whitney U检验确定。

分子对接筛选出16α-HTA和泽泻醇A两种优先候选成分

研究人员通过分子对接评估10种已鉴定柴归汤成分与GPER蛋白的潜在结合能力。对接结合自由能用于评价预测受体-配体复合物的稳定性，数值越低，通常表示预测结合越有利、复合物越稳定。

每种化合物均进行了10次独立分子对接模拟。按照研究采用的评分标准，对接评分绝对值大于5.0通常提示具有较好的结合活性。结果显示，16α-HTA和泽泻醇A的预测结合表现最为突出，对接评分分别为−5.56和−5.11。因此，两者被确定为后续实验验证的优先候选成分。

为分析两种化合物与GPER-1的具体相互作用，研究人员使用PyMOL和PoseView对最优对接构象进行分析。

16α-HTA可与GPER-1的Arg-155、Arg-169和Arg-254形成氢键，并与Arg-253、Ile-93和Thr-92形成疏水相互作用。泽泻醇A可与Arg-169和Lys-171形成氢键，并与Lys-171、Ile-93和Thr-92发生疏水相互作用。

这些结果提示，16α-HTA和泽泻醇A可能通过占据GPER-1结合口袋，并形成特定的氢键和疏水相互作用，构成相对稳定的受体-配体复合物。

图3：GPER候选配体的分子对接分析。（a）10种候选化合物进入GPER结合口袋后的预测结合自由能，单位为kcal/mol。每种化合物均进行了10次独立的分子对接模拟。（b、c）结合排名最高的两种候选成分在GPER-1结合位点中的预测结合模式详图：（b）16α-HTA；（c）泽泻醇A。图中显示了参与氢键或疏水相互作用的关键氨基酸残基。

CETSA证实两种候选成分能够直接结合GPER

研究人员进一步采用细胞热迁移分析验证候选配体与GPER之间的结合。CETSA的基本原理是，配体与靶蛋白结合后可能提高靶蛋白的热稳定性，使其在加热条件下更不容易发生变性和聚集。

研究首先在37～70 ℃的温度梯度下检测细胞裂解物中GPER-1的稳定性。与载体对照相比，分别加入10 μmol/L 16α-HTA或泽泻醇A后，在55～70 ℃条件下可检测到更多可溶性GPER-1蛋白。

其中，泽泻醇A在55、60、65和70 ℃条件下均明显提高了GPER的稳定性。综合结果表明，16α-HTA和泽泻醇A均能够与GPER-1直接结合，并提高靶蛋白的热稳定性。

图4：采用CETSA验证候选配体与HEK293T-GPER1细胞中GPER的结合。**在37～70 ℃温度梯度下，分别检测加入10 μmol/L 16α-HTA、10 μmol/L泽泻醇A或载体对照二甲基亚砜（DMSO）时GPER的热稳定性变化。（a、c）3次独立实验中GPER及上样内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）的代表性免疫印迹图。（b、d）对可溶性GPER蛋白水平进行定量，并以相应37 ℃组为参照。数据以均值±标准差表示，n=3。

16α-HTA和泽泻醇A下调GPER表达并抑制AKT磷酸化

GPER可通过直接或间接机制调控AKT信号通路，进而影响细胞信号传递。为判断两种候选配体能否调节GPER相关信号，研究人员以MDA-MB-231人乳腺癌细胞为模型，并将EGFR/PI3K-AKT通路作为功能评价指标。

Western blot结果显示，与对照组相比，使用0.5、1和5 μmol/L泽泻醇A或16α-HTA处理24小时后，GPER蛋白表达均显著降低。

在0.5 μmol/L低剂量下，两种化合物均显著降低了磷酸化AKT与总AKT的比值，即p-AKT/AKT比值。这一效应与已知GPER拮抗剂G-15的作用方向一致。值得注意的是，AKT磷酸化受到抑制时，EGFR蛋白表达并未发生显著变化。

其他结果显示，仅5 μmol/L G-15可降低p-AKT蛋白水平，而0.5 μmol/L 16α-HTA可提高总AKT蛋白表达。综合分析提示，低剂量16α-HTA和泽泻醇A可下调GPER蛋白表达，并通过不依赖EGFR表达变化的机制抑制AKT磷酸化。

图5：16α-HTA和泽泻醇A对MDA-MB-231细胞中GPER及AKT信号的影响。（a）细胞分别以0.5、1.0和5.0 μmol/L 16α-HTA或泽泻醇A处理24小时后，检测GPER、总AKT、磷酸化AKT（p-AKT）和EGFR的蛋白表达水平；GPER激动剂G-1（0.5和1.0 μmol/L）作为阳性对照，GPER拮抗剂G-15（5和10 μmol/L）作为阴性对照。（b—e）蛋白表达的定量分析：（b）GPER；（c）总AKT；（d）p-AKT；（e）p-AKT/AKT比值。数据以GAPDH进行归一化，并以均值±标准差表示，n=3次独立实验。统计学显著性采用单因素方差分析及事后检验确定。与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

【贡献】★★★★★

本研究以柴归汤为例，成功建立了一套从复杂混合物中筛选活性成分的新型综合策略。

该策略首先在活细胞中完成配体捕获，将完整细胞介导的结合、细胞膜收集与裂解，以及UPLC-QTOF/MS快速鉴定整合在同一工作流程中。随后，研究通过分子对接计算理论结合亲和力并确定优先候选成分，再采用CETSA和细胞功能实验进行实验验证。

研究最终确定，泽泻醇A和16α-HTA是柴归汤中能够与GPER结合的生物活性成分。该工作流程为从传统中药及其他复杂天然产物体系中系统发现活性配体提供了可借鉴的研究框架。

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