J Autoimmun｜他克莫司纳米递送重塑AIH免疫平衡：NC-TAC增强Treg抑制功能并减轻肝脏炎症！(Maria Serena Longhi团队—哈佛医学院)

2026年7月20日，美国贝斯以色列女执事医疗中心、哈佛医学院Maria Serena Longhi团队与巴西南里奥格兰德联邦大学Graziela S. Gomes等，联合德国汉堡-埃彭多夫大学医学中心等单位，在Journal of Autoimmunity （中科院1区，IF=6.8）在线发表题为“Immunomodulatory effects of tacrolimus-loaded lipid-core nanocapsules in autoimmune hepatitis”的研究论文。该文于2026年3月17日投稿，7月11日修回，7月12日接收。

自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis，AIH）是一种由异常免疫反应驱动的慢性进展性肝病。其肝损伤主要由辅助性T细胞1（Th1）和辅助性T细胞17（Th17）等效应T细胞介导，而调节性T细胞（regulatory T cells，Tregs）数量或功能不足，无法有效抑制这些致病性免疫反应。

他克莫司（tacrolimus，TAC）能够抑制T细胞活化，可用于部分难治性AIH患者，但其治疗窗较窄，并可能产生显著的全身毒性。为改善TAC的药物递送及免疫调节特征，研究团队将TAC包载于脂质核纳米胶囊中，构建他克莫司负载脂质核纳米胶囊（tacrolimus-loaded lipid-core nanocapsules，NC-TAC）。

研究首先使用AIH患者及健康对照者外周血来源的CD4 T细胞和Tregs开展体外实验。结果显示，与未包载的游离TAC相比，NC-TAC更有利于形成调节性免疫表型：其可提高AIH患者CD4+FOXP3+和CD4+IL-10+细胞的比例，增强Tregs对效应T细胞增殖的抑制能力，并在IL-6和IL-1β构成的炎症环境中维持Treg表型。

进一步的人源化小鼠实验显示，在重建人CD4 T细胞并接受刀豆蛋白A（Concanavalin-A，Con-A）诱导急性肝损伤的小鼠中，NC-TAC可降低血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平，减轻肝脏淋巴浆细胞浸润和组织学损伤，并提高肝内CD4+FOXP3+细胞比例。

不过，本研究并未在AIH患者体内直接给予NC-TAC，动物实验采用的也是急性T细胞介导肝损伤模型，而非能够完整模拟AIH慢性、复发-缓解过程的疾病模型。因此，NC-TAC目前仍是一种处于早期临床前研究阶段的候选递送体系，其药代动力学、长期安全性及临床疗效仍需进一步验证。

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【摘 要】

自身免疫性肝炎的肝损伤主要由效应T淋巴细胞介导，而调节性T细胞未能对其进行充分抑制。AIH治疗的主要目标是通过糖皮质激素、硫唑嘌呤等免疫抑制药物控制炎症并诱导疾病缓解；对于部分难治性患者，还可使用吗替麦考酚酯或他克莫司。

尽管TAC具有较强的免疫抑制作用，但其临床应用受到治疗窗较窄和全身毒性等因素限制。

本研究评价了包载TAC的脂质核纳米制剂NC-TAC，探讨其能否作为一种新型药物递送系统，相较于未包载的游离TAC产生更有利的免疫调节作用。

研究首先在体外使用AIH患者和健康对照者外周血中分离的CD4 T细胞及Tregs评价NC-TAC的作用。随后，在预先重建人CD4 T淋巴细胞的NOD/scid/gamma小鼠中，通过Con-A诱导T细胞介导的肝损伤，以评价NC-TAC的体内作用。

与未包载的TAC相比，NC-TAC可促进AIH患者CD4 T细胞形成调节性表型，增强Tregs的免疫抑制功能，并在炎症刺激下维持AIH患者Tregs的表型稳定性。

全身给予NC-TAC还可减轻小鼠肝损伤，表现为血清ALT水平下降、组织学检查中淋巴细胞浸润减少，以及肝内CD4+FOXP3+淋巴细胞比例升高。

因此，NC-TAC可被视为一种值得进一步研究的新型TAC递送系统。该纳米制剂具有较为有利的免疫调节特征，能够增强Treg相关免疫反应，可能为AIH治疗提供新的临床前研究方向。

01

研究背景及科学问题

自身免疫性肝炎是一种慢性、进行性肝病，主要影响女性。其临床和病理特征包括高丙种球蛋白血症、血清自身抗体阳性及组织学界面性肝炎。

AIH通常呈复发-缓解性病程。即使接受免疫抑制治疗，部分患者仍可能进展至终末期肝病，并最终需要接受肝移植。

AIH肝损伤主要由Th1和Th17细胞介导，而这些效应T细胞未能受到Tregs的充分抑制。功能异常的Tregs在AIH中发挥重要的容许作用，使效应细胞免疫反应持续存在并不断推动肝损伤。

目前，免疫抑制治疗仍是AIH治疗的核心，常用方案包括糖皮质激素和硫唑嘌呤。替代治疗方案还包括吗替麦考酚酯以及环孢素、TAC等钙调神经磷酸酶抑制剂。

这些药物可使相当一部分患者实现生化缓解。然而，在现有制剂形式下，其使用往往伴随明显不良反应，可能影响患者生活质量及治疗依从性。

TAC是一种强效免疫抑制剂，能够抑制T细胞活化，因此被用于多种自身免疫性疾病。但其治疗窗较窄，并具有较明显的全身毒性，限制了临床应用。

近年来，纳米技术的发展为解决上述问题提供了新的可能。通过改善药物递送和靶向特性，纳米制剂可能降低非靶组织暴露并优化药物作用。

脂质核纳米胶囊（lipid-core nanocapsules，NC）是一类创新型药物递送系统，能够保护药物免受降解、提高生物利用度并实现药物的控制释放，从而在增强药物作用的同时降低不良反应。

在此基础上，将TAC包载于脂质核纳米胶囊中形成NC-TAC，可能提高TAC在AIH等自身免疫性疾病中的应用潜力。

本研究使用AIH患者和健康对照者外周血来源的CD4 T细胞及Tregs，在体外比较NC-TAC与游离TAC的作用；同时使用人源化小鼠肝损伤模型，评价NC-TAC的体内效果。

研究结果显示，NC-TAC可增强AIH中的调节性免疫反应，提高Treg抑制功能并维持其免疫表型，同时减轻实验性肝损伤。与未包载的TAC相比，NC-TAC可能具有更有利的免疫调节特征。

02

重要发现及亮点

NC-TAC具有均一粒径和较高药物包封率

激光衍射分析显示，研究制备的脂质核纳米胶囊呈单峰粒径分布，样品中主要为纳米尺度颗粒，其体积加权平均粒径为185±10 nm。

包载TAC并未明显改变脂质核纳米胶囊的粒径。制剂的多分散性跨度值均低于1.6，表明颗粒尺寸分布相对集中。

纳米胶囊的ζ电位为−14.3±1.3 mV，反映了聚己内酯和聚山梨酯80形成的表面特征。所有制剂均呈轻度酸性，pH为4.9±0.3。

色谱分析显示，NC-TAC中的实际药物含量接近理论值0.8 mg/mL，其TAC包封率接近100%。这些结果表明，NC-TAC具有较为均一的粒径分布、较窄的分散范围及较高的药物负载效率。

NC-TAC抑制AIH患者CD4 T细胞增殖，同时避免明显增加细胞凋亡

研究从健康受试者和AIH患者外周血中分离CD4 T细胞，在CD3/CD28和白细胞介素-2（IL-2）刺激下，分别加入溶剂对照、空白纳米胶囊（NC）、NC-TAC或游离TAC。

NC-TAC可降低健康受试者和AIH患者CD4 T细胞的增殖，但这一变化仅在AIH患者细胞中达到统计学显著性。游离TAC则在两组中均降低CD4 T细胞增殖。在同一人群内部，NC-TAC与游离TAC对CD4 T细胞增殖的抑制程度没有显著差异。

在健康受试者CD4 T细胞中，与溶剂对照相比，NC、NC-TAC和游离TAC均降低早期凋亡细胞比例。不过，游离TAC处理后的早期凋亡细胞比例高于NC和NC-TAC。

AIH患者CD4 T细胞接受NC处理后，早期凋亡细胞比例下降；游离TAC组的早期凋亡比例则呈现高于NC组的趋势。

在健康受试者细胞中，游离TAC显著增加晚期凋亡CD4 T细胞比例，而NC-TAC未表现出相同变化。AIH患者细胞接受不同处理后，晚期凋亡比例未见明显改变。

总体而言，NC-TAC能够抑制AIH患者CD4 T细胞增殖，同时基本不改变其凋亡细胞比例。

图1：NC-TAC对CD4 T细胞增殖和凋亡的影响。从自身免疫性肝炎患者和健康受试者（HS）外周血中分离CD4 T细胞，在Dynabeads Human T activator CD3/CD28和IL-2刺激下，分别加入溶剂对照、空白纳米胶囊（NC）、他克莫司负载纳米胶囊（NC-TAC）或未包载的游离TAC，检测其增殖能力。采用CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay评价细胞增殖，并通过490 nm处吸光度表示。（A、B）小提琴图显示CD4 T细胞在溶剂对照、NC、NC-TAC或TAC处理下的490 nm吸光度；健康受试者n=5，AIH患者n=7。采用流式细胞术检测CD4 T细胞的早期和晚期凋亡，其中Annexin V阳性细胞为早期凋亡细胞，Annexin V和碘化丙啶双阳性细胞为晚期凋亡细胞。（C、D）溶剂对照、NC、NC-TAC或TAC处理后早期凋亡CD4 T细胞的比例。（E、F）晚期凋亡CD4 T细胞的比例；健康受试者n=5，AIH患者n=5。*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001；采用单因素方差分析，并进行Tukey多重比较检验。每个小提琴图均显示中位数和四分位数。对于AIH患者来源的细胞，NC-TAC可抑制CD4 T淋巴细胞增殖，同时基本不改变凋亡细胞比例。

NC-TAC促进AIH患者CD4 T细胞形成调节性免疫表型

研究进一步通过流式细胞术分析FOXP3、RAR相关孤儿受体C（RORC）、IL-10、IL-17A和干扰素γ（IFNγ）在CD4 T细胞中的表达。

在AIH患者样本中，与游离TAC相比，NC-TAC处理后CD4+FOXP3+细胞比例更高；与溶剂对照相比，NC-TAC还提高了CD4+IL-10+细胞比例。

游离TAC处理后，AIH患者CD4+FOXP3+细胞比例低于空白NC组，同时CD4+IL-17A+细胞比例呈现高于NC-TAC和NC组的趋势。

在健康受试者样本中，与溶剂对照或NC相比，游离TAC增加了CD4+RORC+和CD4+IFNγ+细胞比例；与NC-TAC相比，游离TAC还提高了CD4+IL-17A+细胞比例。

按照AIH患者的疾病状态进行分析后发现，在缓解期患者中，与游离TAC相比，NC-TAC处理后CD4+FOXP3+细胞比例更高。游离TAC处理后的CD4+FOXP3+细胞比例则低于NC组。

在复发期患者中，游离TAC处理后CD4+IL-17A+细胞比例较高。缓解期和复发期患者的RORC、IL-10和IFNγ阳性CD4 T细胞比例未因不同处理出现显著差异。

这些结果表明，NC-TAC在控制AIH患者CD4 T细胞增殖的同时，可促进其形成更偏向免疫调节的表型，而未包载的TAC在部分实验条件下可能更倾向于形成促炎性表型。

图2：NC-TAC促进AIH患者CD4 T细胞形成调节性表型。采用流式细胞术检测溶剂对照、NC、NC-TAC或TAC处理后，CD4 T细胞中FOXP3、RORC、IL-10、IL-17A和IFNγ阳性细胞的比例。小提琴图分别显示（A）CD4+FOXP3+、（B）CD4+RORC+、（C）CD4+IL-10+、（D）CD4+IL-17A+和（E）CD4+IFNγ+细胞比例；健康受试者n=6～8，AIH患者n=6～12。*P≤0.05，**P≤0.01；采用单因素方差分析，并进行Tukey多重比较检验。每个小提琴图均显示中位数和四分位数。NC-TAC可促进AIH患者CD4 T细胞形成调节性免疫表型。

NC-TAC增强AIH患者Tregs的免疫抑制功能

鉴于NC-TAC对CD4 T细胞群体表现出有利作用，研究进一步评价其对健康受试者和AIH患者外周血来源Tregs的影响。

与溶剂对照或空白NC相比，NC-TAC未明显改变健康受试者和AIH患者Tregs的增殖。相反，在健康受试者中，游离TAC显著降低了Treg增殖。

随后，研究通过检测Tregs抑制CD4+CD25−效应细胞增殖的能力，评价其免疫抑制功能。

在AIH患者样本中，与溶剂对照或空白NC相比，NC-TAC显著增强Tregs的抑制功能。缓解期与复发期患者来源的Tregs接受NC、NC-TAC或游离TAC处理后，其抑制功能未表现出显著差异。

这表明NC-TAC能够在不明显抑制Treg自身增殖的情况下，提高AIH患者Tregs对效应T细胞的抑制能力。

图3：NC-TAC增强AIH患者Tregs的免疫抑制功能。从健康受试者和AIH患者外周血中分离Tregs，在Dynabeads Human T activator CD3/CD28和IL-2刺激下，分别接受溶剂对照、NC、NC-TAC或未包载TAC处理，并检测其增殖能力。（A）小提琴图显示不同处理条件下Tregs的490 nm吸光度；健康受试者n=16，AIH患者n=9。Tregs的抑制功能以其对CD4+CD25−细胞增殖的抑制百分比表示。（B）小提琴图显示经过溶剂对照、NC、NC-TAC或TAC处理的Tregs，在共培养实验中对CD4+CD25−细胞增殖的抑制百分比；健康受试者n=6，AIH患者n=5。*P≤0.05，**P≤0.01；采用单因素方差分析，并进行Tukey多重比较检验。每个小提琴图均显示中位数和四分位数。NC-TAC可增强AIH患者Tregs的免疫抑制功能。

NC-TAC在炎症环境中维持AIH患者Treg表型

既往研究显示，AIH患者Tregs在炎症环境中可能获得效应T细胞特征。研究因此使用IL-6和IL-1β构建促炎刺激，评价NC-TAC能否维持Treg表型。

由于该实验需要较多细胞，研究首先在IL-2、转化生长因子β（TGF-β）和CD3/CD28刺激条件下，将初始CD4 T细胞极化为Tregs。

在AIH患者来源的Tregs中，炎症刺激导致FOXP3表达呈下降趋势，IL-17A表达呈升高趋势。加入NC-TAC后，上述变化受到抑制，表现为FOXP3表达升高、IL-17A表达下降。

即使在不存在促炎刺激的情况下，与溶剂对照相比，NC-TAC处理组AIH患者Tregs的FOXP3水平也更高，而IL-17A水平更低。

无论是否存在促炎刺激，与溶剂对照相比，NC-TAC均可提高AIH患者Tregs中的IL-10水平。游离TAC也可在部分条件下提高IL-10，但没有表现出NC-TAC在FOXP3和IL-17A方面的完整调节模式。

NC、NC-TAC和游离TAC均未明显影响健康受试者或AIH患者Tregs中的RORC水平。

在AIH缓解期患者来源的Tregs中，促炎刺激下NC-TAC处理后的FOXP3 mRNA水平高于游离TAC或溶剂对照。无论是否存在促炎刺激，NC-TAC或游离TAC均可降低缓解期患者Tregs的IL-17A表达。

总体而言，NC-TAC能够增强AIH患者Tregs的抑制功能，并在促炎环境中维持其免疫调节性表型。

图4：NC-TAC在炎症环境中维持AIH患者Treg表型。研究在IL-6和IL-1β构成的炎症刺激下评价Treg表型的维持情况。由于该实验需要较多细胞，研究将初始CD4 T细胞暴露于IL-2、TGF-β和Dynabeads Human T activator CD3/CD28，以扩增并获得Tregs。小提琴图分别显示（A）FOXP3、（B）RORC、（C）IL-10和（D）IL-17A的mRNA水平。各组包括未接受或接受促炎刺激的溶剂对照，以及接受促炎刺激并分别加入NC、NC-TAC或TAC的处理组；健康受试者n=9，AIH患者n=10。结果以相对于未接受促炎刺激的溶剂对照组的倍数变化表示。*P≤0.05，**P≤0.01；采用单因素方差分析，并进行Tukey多重比较检验。每个小提琴图均显示中位数和四分位数。NC-TAC可在促炎刺激存在时维持AIH患者Tregs的表型。

NC-TAC减轻人源化小鼠的T细胞介导性肝损伤

研究进一步在体内评价NC-TAC的作用。实验使用NOD/scid/gamma免疫缺陷小鼠，并预先输入一名健康供者外周血来源的人CD4 T细胞，构建人源化小鼠。

确认人CD4 T细胞重建后，小鼠分别接受溶剂对照、空白NC、NC-TAC或游离TAC处理，随后给予Con-A诱导急性T细胞介导性肝损伤。

与溶剂对照相比，NC-TAC处理可降低小鼠血清ALT水平。组织学结果显示，与溶剂对照、空白NC或游离TAC相比，NC-TAC可降低改良Ishak组织学活动指数（modified Histological Activity Index，mHAI），并减少肝组织淋巴浆细胞浸润。

对肝内人CD4 T细胞进行表型分析后发现，NC-TAC提高了CD4+FOXP3+细胞比例。与溶剂对照相比，NC-TAC和游离TAC均降低肝内CD4+IL-17A+细胞比例。

不同处理未明显改变肝内CD4+IL-10+和CD4+IFNγ+细胞比例，也未改变脾脏组织结构及脾脏中FOXP3、IL-10、IL-17A或IFNγ阳性CD4 T细胞的比例。

这些结果表明，在人源化小鼠急性肝损伤模型中，NC-TAC能够减轻肝脏炎症，其作用伴随肝内CD4+FOXP3+调节性细胞比例增加和CD4+IL-17A+效应细胞比例下降。

图5：NC-TAC在体内减轻肝脏炎症。NOD/scid/gamma小鼠接受人CD4 T细胞重建，并在Con-A诱导急性肝炎前20 h分别接受溶剂对照、NC、NC-TAC或未包载的游离TAC处理。小鼠接受Con-A处理4 h后处死。接受人CD4 T细胞重建但未接受Con-A处理的小鼠作为无Con-A对照组。（A）血清ALT水平的箱线图。（B）未接受Con-A处理的小鼠以及分别接受溶剂对照、NC、NC-TAC或TAC处理小鼠的改良Ishak组织学活动指数评分和淋巴浆细胞浸润评分；无Con-A组n=2，溶剂对照组n=5，NC组n=5，NC-TAC组n=5，TAC组n=5。（C）溶剂对照、NC、NC-TAC或TAC处理代表性小鼠肝组织切片的H&E染色和人CD3染色；原始放大倍数×10，比例尺=200 μm。箱线图分别显示肝内CD4 T淋巴细胞中（D）FOXP3、（E）IL-10、（F）IL-17A和（G）IFNγ阳性细胞的比例。所有小图中，无Con-A组仅作为基线参考，其样本量不足以进行正式统计学比较。*P≤0.05，**P≤0.01；采用单因素方差分析，并进行Tukey多重比较检验。

【贡献】★★★★★

本研究表明，他克莫司负载脂质核纳米胶囊能够在体外促进调节性免疫反应，并在体内减轻T细胞介导的实验性肝损伤。

研究制备的脂质核纳米胶囊具有较为均一的粒径分布、较窄的分散范围和接近100%的药物包封率。TAC的加入未明显改变纳米胶囊的粒径，有助于维持制剂的稳定性和宏观均一性。

与未包载的TAC相比，NC-TAC在AIH患者来源的CD4 T细胞中提高了FOXP3和IL-10阳性细胞比例，表现出更有利的调节性免疫特征。

NC-TAC还增强了AIH患者Tregs对效应T细胞增殖的抑制能力，并在IL-6和IL-1β构成的促炎环境中提高FOXP3和IL-10、降低IL-17A，从而维持Tregs的免疫调节表型。

在重建人CD4 T细胞并接受Con-A刺激的小鼠中，NC-TAC降低了血清ALT和肝组织学损伤评分，减少了淋巴浆细胞浸润，并提高肝内CD4+FOXP3+细胞比例。与游离TAC类似，NC-TAC还降低了肝内CD4+IL-17A+细胞比例。

不过，当前体外实验所使用的AIH患者均未接受TAC治疗，因此既往或正在使用游离TAC是否会影响患者细胞对NC-TAC的反应，仍需进一步研究。

此外，动物实验采用的是Con-A诱导的急性T细胞介导性肝损伤模型，不能完整模拟AIH慢性、复发-缓解性的自然病程。未来仍需在更具AIH疾病特异性的临床前模型中评价NC-TAC的长期作用。

研究还需要进一步明确NC-TAC的体内靶向递送能力、药代动力学和药效学特征，并分析其对B细胞、巨噬细胞和CD8 T细胞等其他AIH相关免疫细胞的影响。

总体而言，NC-TAC具有增强Treg免疫反应和调节CD4 T细胞表型的作用，并可减轻人源化小鼠中的急性T细胞介导性肝损伤。研究结果支持继续探索基于纳米技术的免疫调节策略，但其用于AIH治疗的有效性和安全性仍需通过更多临床前研究及后续临床试验进行验证。

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