Nature Commun | 中国医学科学院饶书权/程涛院士团队发现增强CAR-T细胞抗癌能力的关键基因

CRISPR基因编辑技术的出现为功能性基因筛选提供了强大支撑，但将激活型CRISPR筛选（CRISPRa）应用于原代人类细胞一直面临效率瓶颈。中国医学科学院血液学研究所/血液病医院程涛院士团队完成的研究“Engineered dCas12f1-SAM enables robust transcriptional activation and gain-of-function screening in primary human cells”近日发表于《Nature Communications》。研究团队开发了一套名为dCas12f1-SAM的紧凑型基因转录激活工具，并在原代人类T细胞和造血干祖细胞中验证了其出色的激活效能，还通过该工具筛选出多个能够增强T细胞抗癌活性的关键转录调控因子。 中国医学科学院血液病医院（中国医学科学院血液学研究所）饶书权研究员、程涛院士、姚瑶研究员、程辉研究员和中国科学院天津工业生物技术研究所薛超友研究员为共同通讯作者，中国医学科学院血液病医院（中国医学科学院血液学研究所）曹佳璇博士、博士生柳志睿、陈信文硕士、博士生兰梓琳为共同第一作者。

传统CRISPRa系统多基于Cas9或Cas12a蛋白，这些蛋白尺寸较大，超过了慢病毒载体的高效包装限度，使得在原代细胞中的递送和功能筛选困难重重。研究团队将目光投向了尺寸极小的Cas12f1蛋白。基于已解析的Cas12f1与引导RNA复合物晶体结构，他们系统性地分析了引导RNA各个茎环结构在复合物中的空间位置。他们发现，位于复合物外部的茎环1、茎环2、茎环4以及反向重复序列与重复序列2的配对区域可作为外源功能模块的插入位点。通过在这些位点接入MS2 RNA适配体，他们得以利用MS2噬菌体外壳蛋白融合的转录激活因子来增强基因转录。在测试了多种不同位点组合和适配体拷贝数的引导RNA支架后，scaffold 2.1这一变体表现最为突出。相比之前报道的dCasMINI-VPR系统，搭载scaffold 2.1的dCas12f1-SAM对测试的内源基因实现了8.0到160.6倍不等的转录激活提升。

研究人员随后将dCas12f1-SAM拆分为两个独立的慢病毒载体，一个表达dCasMINI-VP64融合蛋白，另一个同时表达激活因子和引导RNA。在人类原代T细胞中，含有dCasMINI-VP64编码序列的慢病毒载体因尺寸紧凑，在中低感染复数下即可实现超过80%的阳性细胞比例，而传统dCas9-VP64载体在相同条件下阳性率仅约为30%。在更加难以转导的造血干祖细胞中，dCas12f1-SAM同样表现出了远优于dCas9-SAM的递送效率。在成功导入目标细胞后，dCas12f1-SAM对CD2、HBG和IFNγ等内源基因的激活效率全面超过了dCas9-SAM系统。在造血干祖细胞向红系分化的模型中，激活HBG基因使胎儿血红蛋白阳性细胞的比例提升了约1.6倍，展示了该系统在遗传性疾病治疗中的潜在应用价值。

研究团队基于dCas12f1-SAM平台设计了一个靶向1559个人类转录因子编码基因的CRISPRa筛选文库，在人类原代T细胞中开展功能筛选。他们以T细胞受抗原刺激后产生的关键效应分子白细胞介素-2为检测指标，通过流式细胞术分选出白细胞介素-2表达量最高和最低的T细胞群体。经过两轮生物学重复筛选和测序分析，共鉴定出114个基因被激活后能够提升白细胞介素-2的产生，69个基因激活后抑制白细胞介素-2的产生。筛选结果中既包含了FOS、FOXQ1等已知调控T细胞功能的分子，也发现了PRDM8、KLF12、LHX5等尚未在原代T细胞功能筛选中被报道过的转录因子。研究团队进一步建立了名为miCROP-seq的单细胞转录组与CRISPR扰动偶联平台。在单细胞水平上，他们分别检测了26个阳性筛选靶点和3个非靶向对照的扰动效应，发现不同转录因子的激活将T细胞引向了功能各异的细胞状态。其中，KLF12和LHX5的激活在单细胞数据中与高水平的白细胞介素-2、肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ表达显著相关。

研究团队选取KLF12和LHX5进行深入的功能验证。他们构建了同时表达靶向CD19的嵌合抗原受体（CAR）以及KLF12或LHX5的三顺反子慢病毒载体，并转导至原代T细胞中。在与CD19阳性的肿瘤靶细胞共培养后，过表达KLF12或LHX5的CAR-T细胞分泌的白细胞介素-2和干扰素-γ水平显著高于对照组CAR-T细胞。在不同效靶比条件下，KLF12或LHX5过表达组的肿瘤杀伤效率均显著提高。在异种移植小鼠白血病模型中，注射了过表达KLF12或LHX5的CAR-T细胞的小鼠肿瘤负荷得到有效抑制，生存期显著延长。该研究不仅提供了一套性能卓越的紧凑型基因转录激活工具，还发现了两个能够增强CAR-T细胞抗肿瘤功能的转录因子，为细胞免疫疗法的优化开辟了新路径。

READING

BioPeers