《食品科学》：武汉轻工大学许琳副教授等：牛奶中金黄色葡萄球菌胶体金免疫层析快速检测方法的建立与应用

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种典型的革兰氏阳性食源性致病菌，其广泛分布于自然环境和生物体中，如水、空气、尘埃以及人与动物的排泄物等。该菌的致病性主要归因于其分泌的多种毒力因子，其中肠毒素是导致食源性疾病的关键物质，此外如α-溶血毒素、杀白细胞素等也能协同增强其毒力。这些毒素进入人体后，不仅可干扰肠道正常功能，更可作为超抗原引发剧烈的免疫应答，临床常表现为急性胃肠炎症状，包括恶心、剧烈呕吐、腹痛及腹泻等，对消费者健康构成严重威胁。近年来，由金黄色葡萄球菌污染的乳制品引发的食品安全事件在全球范围内频繁发生，已成为一个持续存在且亟需重视的全球性公共卫生问题。由于乳制品原料特性及其较长的加工链条，从生乳获取、加工生产、包装到贮运销售的全产业链各环节，均存在不同程度的金黄色葡萄球菌污染风险。鉴于金黄色葡萄球菌污染的高发性与健康危害的严重性，GB 29921—2021《预包装食品中致病菌限量》已针对乳制品等多类食品，明确设定了金黄色葡萄球菌的限量标准，以管控相关食品安全风险。

在金黄色葡萄球菌检测方面，传统的分离培养法被视为“金标准”，具备高准确性与可靠性，但其操作流程复杂、耗时冗长，难以满足现代社会对食品安全防控日益增长的快速响应需求。随着分子生物学与免疫学技术的飞速进步，针对金黄色葡萄球菌的检测技术已得到迅速发展并广泛应用。目前国内外常见的金黄色葡萄球菌检测方法有酶联免疫吸附试验（ELISA）、聚合酶链式反应（PCR）和免疫层析法（ICA）。虽然ELISA和PCR有精确度高、准确性好、适用于批量检测等优点，但是这些方法所需数据读取设备一般体积较大，携带不便，不利于现场快速筛查。因此，迫切需要建立一种高效便捷、操作简便和低成本的金黄色葡萄球菌检测方法，为乳及乳制品中金黄色葡萄球菌的现场快速筛查与监测提供技术支撑。

ICA是一种高效检测食品中有毒有害物质的快速检测方法，该方法操作简便、不需要特殊仪器，通过肉眼即可判断结果，能够满足现场快速检测的需求。目前虽已报道多种金黄色葡萄球菌免疫层析检测技术，但系统分析基质效应对试纸条检测性能影响的研究相对较少。然而，在实际食品检测场景中，复杂的食品基质成分会影响检测结果的准确性和灵敏度。因此，武汉轻工大学食品科学与工程学院的卢晨阳、黄晶和许琳*等以金纳米颗粒（AuNPs）为信号标签，制备免疫探针AuNPs-pAb1，构建免疫层析试纸条，并以脱脂牛奶、低脂牛奶和全脂牛奶为实际样品，系统分析不同脂肪含量食品基质（牛奶）对试纸条检测性能的影响。

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AuNPs的表征

本实验采用柠檬酸三钠还原氯金酸的方法制备AuNPs，并利用紫外-可见吸收光谱对其光学性质进行表征。如图2A所示，所制备胶体金溶液的最大吸收波长位于520 nm。进一步通过透射电子显微镜观察纳米颗粒的形貌与粒径分布，结果如图2B所示，所制备的AuNPs的粒径分布均匀，粒径约为18～20 nm，表现出良好的单分散性。

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免疫探针的标记条件

本研究分别对免疫探针制备过程中的标记pH值（通过K2CO3溶液浓度调节）、抗体1用量进行系统优化。K2CO3属于强碱弱酸盐，其水溶液呈碱性，可用于将AuNPs的pH值调节至略高于所用多克隆抗体的等电点，进而在接近抗体最适标记的弱碱性条件下，实现对抗体更高效、更稳定的共价标记。通过K2CO3溶液调节反应体系的pH值制备免疫探针，随后在抗体标记AuNPs过程中，当pH值不合适时AuNPs会出现不同程度的聚集，且吸光度会相应降低。如图3A所示，当每毫升胶体金溶液加入6 μL浓度为0.1 mol/L的K2CO3溶液时，胶体金溶液的吸光度最大。因此，确定该条件为免疫探针合成的最佳标记pH值条件。免疫探针中抗体1的用量直接影响T线的颜色。图3B显示，1～4号离心管中AuNPs出现不同程度的颜色变紫现象，表明发生聚沉；5号管为维持AuNPs分散状态不变色的最小抗体加入量，其对应蛋白添加量为25 μg。因此，每毫升AuNPs加入30 μg抗体1制备免疫探针（以25 μg为基础增加20%）。综上，每毫升胶体金溶液加入6 μL浓度为0.1 mol/L的K2CO3溶液且加入30 μg抗体1时为免疫探针制备的最佳条件。在此条件下所获得的免疫探针分散稳定、颜色呈典型酒红色。

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免疫探针的表征

在AuNPs-pAb1免疫探针合成过程中，随着AuNPs表面结合越来越多的抗体，其最大吸收峰从520 nm增大到528 nm（图4A），发生了明显的红移，表明抗体偶联成功。在AuNPs与抗体偶联后，抗体会对AuNPs表面电荷起到屏蔽作用，导致表面电荷减弱，Zeta电位从－33.67 mV增加到－16 mV（图4B），变化明显，表明免疫探针成功合成。随着标记过程中AuNPs表面结合抗体，AuNPs的流体动力学尺寸增大，粒径从18.3 nm增加到了30.9 nm（图4C），同时由于抗体对表面电荷的掩蔽，导致在电场中的迁移速率相应下降，泳道1代表AuNPs、泳道2代表AuNPs-pAb1，与AuNPs的电泳速度相比，AuNPs-pAb1的移动速度明显降低（图4D）；这些结果均表明抗体1已经成功修饰到AuNPs表面，证明免疫探针成功制备。

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免疫剂量的优化

C线二抗与T线抗体2的浓度会影响C线和T线的显色情况。如图5A所示，相比于1号和3号，2号试纸条的显色适中，既能起到质控作用又能避免因颜色过深干扰结果判读，因此C线二抗的最佳质量浓度为 0.75 mg/mL；在图5B中，试纸条1、2的T线颜色较浅，说明未能完全捕获免疫探针与金黄色葡萄球菌形成的复合物，而试纸条3和4的T线颜色相当，为了节约抗体的用量选择试纸条3为最佳实验组，故T线抗体2的最佳质量浓度为0.8 mg/mL。

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灵敏度

在最佳检测条件下，用试纸条进行灵敏度检测，结果如图6所示，当金黄色葡萄球菌浓度小于104 CFU/mL时，T线未出现红色条带，当金黄色葡萄球菌的浓度≥104 CFU/mL时，T线位置显现出红色条带，且随着金黄色葡萄球菌的浓度增大，T线颜色逐渐加深。该试纸条的可视检出限为104 CFU/mL。然后用ImageJ读取T线和C线的灰度值并进行分析，发现T/C与金黄色葡萄球菌浓度的对数呈现相关关系：当金黄色葡萄球菌浓度为104～107 CFU/mL时，线性关系为T/C＝0.26lg CS. aureus－0.86，决定系数R2＝0.98，定量检出限为9.52×103 CFU/mL。

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特异性分析

本实验对试纸条的特异性进行评价，结果如图7所示，试纸条对其他常见食源性致病菌如大肠杆菌、沙门氏菌以及单核细胞增生李斯特菌没有交叉反应，pAb1可特异性识别包括金黄色葡萄球菌表面蛋白A在内的多个表位，确保能够特异性识别金黄色葡萄球菌。综上，该试纸条针对金黄色葡萄球菌具有良好的特异性。

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实际样品检测

所构建的试纸条在脱脂牛奶、低脂牛奶和全脂牛奶等不同实际样品基质中均表现出良好的检测性能。如图8所示，对该检测方法的基质效应进行系统评估，3 种样品（脱脂牛奶、低脂牛奶和全脂牛奶）的基质因子分别为0.963、0.954和0.946，均小于1，表明三者均存在一定程度的基质抑制效应。脱脂牛奶的基质抑制效应主要源于牛奶中固有蛋白质、乳糖及无机盐等成分，通过非特异性吸附干扰抗原抗体识别结合，进而影响检测灵敏度。而低脂和全脂牛奶基质因子更低，除上述共同干扰外，其高含量脂肪球可加剧非特异性吸附、产生空间位阻，进一步削弱免疫识别效率，基质抑制效应更为显著。表明牛奶中的复杂成分对免疫识别反应及信号产生仅存在轻微干扰。上述结果说明，本方法具有良好的检测性能，基质干扰较小，能够适用于乳制品中金黄色葡萄球菌的快速检测。

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试纸条准确性评价

为了评估试纸条的准确性，对人工制备金黄色葡萄球菌污染的牛奶（脱脂、低脂和全脂）样品进行检测，每种样品设置3 个浓度，并将结果与平板计数法的结果进行了比对，实验结果如表1所示，在脱脂牛奶中的加标回收率为89.35%～96.77%，在低脂牛奶中的加标回收率为89.41%～112.78%，在全脂牛奶中的加标回收率为82.72%～89.56%。综上，牛奶样品的脂肪含量会影响试纸条的检测性能，脂肪含量越高，回收率越低，但3 种牛奶基质的加标回收率均处于80%～120%的可接受范围，表明AuNPs试纸条在牛奶样品中具有良好的适用性。使用AuNPs试纸条和平板计数法分别检测不同浓度的样本，Wilcoxon符号秩检验结果显示，两种方法无显著差异（P＝0.066）。表明试纸条的检测结果与平板计数法结果一致，说明其在实际样品检测中具有良好的准确性及潜在的应用价值。

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结 论

本研究系统优化了AuNPs的标记条件，成功制备了用于检测金黄色葡萄球菌的试纸条，并得出以下结论：AuNPs标记抗体1的最适pH值条件为在每毫升胶体金溶液中加入6 μL浓度为0.1 mol/L的K2CO3溶液；抗体1的最佳标记质量浓度为30 μg/mL。在试纸条制备方面，C线所用二抗与T线所用抗体2的最佳包被质量浓度分别为0.75 mg/mL 与0.8 mg/mL。在上述优化条件下制备的试纸条对金黄色葡萄球菌表现出较高的灵敏度，其可视检出限为104 CFU/mL，定量检出限为9.52×103 CFU/mL。本实验以脱脂牛奶、低脂牛奶和全脂牛奶为实际样品分析了不同样品基质对试纸条检测性能的影响。结果显示3 种样品的基质因子分别为0.963、0.954和0.946，均小于1，说明3 种基质均存在一定的基质抑制效应。该试纸条制备工艺简单，无需依赖复杂仪器设备。与GB 4789.10—2016中的平板计数法比对结果具有良好一致性，表明所建立的方法可靠可行。本方法相较于现有方法具有操作简便、成本低廉的优势，在牛奶样品中表现出良好的适用性，并且具有良好的应用前景。

引文格式：

卢晨阳, 黄晶, 王晓娟, 等. 牛奶中金黄色葡萄球菌胶体金免疫层析快速检测方法的建立与应用[J]. 食品科学, 2026, 47(14): 362-369. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20260126-212.

LU Chenyang, HUANG Jing, WANG Xiaojuan, et al. Establishment and application of colloidal gold-based immunochromatographic assay for rapid detection of Staphylococcus aureus in milk[J]. Food Science, 2026, 47(14): 362-369. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20260126-212.

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实习编辑：杨瑞蕾；编辑：阎一鸣；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

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