28岁失业青年敲开教授的门，靠“画大饼”聊出一个新产业

在《佛系富二代与“牛津主妇”，破解了胰岛素结构之谜》一文中，，我们看清了胰岛素的一维序列与三维结构，但这只是开始，能不能用人工方法把它从头“搭建”出来？

从中国科学家历时六年合成结晶牛胰岛素，到重组DNA技术横空出世，再到28岁失业青年敲开教授的门、用500美元启动一家改变制药业的公司……现代生物技术产业，就这样从胰岛素开始加速成形。

撰文 | 郑超（中国科学院上海有机化学研究所研究员）

一旦功成：“合成一个蛋白质”

1958年的中国，是一片火热的土地。各行各业都在“鼓足干劲，力争上游”。科研工作者也盼望用自己的聪明才智，为社会主义建设增光添彩。研究什么样的课题才能应得上时代洪流呢？中国科学院上海生物化学研究所的科研人员们集思广益，提出了一个响亮的目标——合成一个蛋白质！这个目标的落脚点自然是胰岛素。

如前文所述，早在20世纪初，费歇尔已经实现了简单多肽的化学合成。但是，剧烈的反应条件极易使氨基酸α位的手性中心消旋化，故其产物无法完全复现天然多肽的结构和功能。1953年，生物化学领域迎来了一项重要突破。美国人杜·维尼奥（V. du Vigneaud）合成了一种具有生理活性的九肽——催产素，并因此获得1955年诺贝尔化学奖。在这项工作中，杜·维尼奥实践了一套行之有效的多肽合成方法：一方面使用缩合剂提升反应活性，让氨基酸的立体化学构型在温和的条件下得以保持；另一方面使用保护基避免在非目标位点发生副反应。此后，血管紧张素II（八肽）、抗利尿激素（九肽）、促肾上腺皮质激素（24肽片段）等多肽类激素相继被合成出来。

那么，可以认为天然多肽、乃至蛋白质的化学合成问题已经被解决了吗？答案是否定的。随着目标肽链的延长，合成时所需要执行的缩合反应的数目也不断增加。如果采用线性逐步连接的方式，即使单步反应的收率达到90%，那么制备30肽（29步反应）的总收率也将小于5%。为了提高合成效率，必须走汇聚式途径，同时从多个位点出发，分别集少成多，最终由长度相当的肽段拼接成目标分子。所以合成路线的设计，包括对肽链拼接位点和顺序的选择、保护基操作的时机等，都必须经过周密安排和充分试错，方能确定最优合成路线。此外，与催产素等单链多肽不同，胰岛素包含两条肽链和三个二硫键（破坏其中任意一个，胰岛素都将丧失活性）。在合成中如何构筑这些二硫键，完全没有先例可循。最理想的情况是分别合成A链和B链，期待六个半胱氨酸的巯基能够自主正确配对。如不可行，则需要首先分别连接两对链间二硫键，形成两个工字型肽段后再相互衔接；或者向三对半胱氨酸的巯基引入不同的保护基，通过选择性去保护的方法实现二硫键的定向构筑。无论哪种方案，都没有百分之百成功的把握。

为了首先解决二硫键构筑的问题，上海生化所邹承鲁、杜雨苍等人开展了天然胰岛素的“拆合”研究：即设法将天然胰岛素的三个二硫键拆开，得到没有活性的A链和B链；再将它们重新组合成具有活性的胰岛素。经过反复试验，研究人员于1959年初发现，利用亚硫酸钠和四硫硫酸钠（现通称连四硫酸钠）可将天然胰岛素拆分为稳定但无活性的A链及B链S-磺酸盐。再用钠-液氨进行还原，得到暴露半胱氨酸巯基的A链和B链。将它们混合后置于强碱性水溶液中被空气缓慢氧化，即可重新生成胰岛素，其活性达到天然胰岛素的5%~10%。进一步用仲丁醇/醋酸萃取，并在含醋酸锌和丙酮的柠檬酸溶液中结晶纯化，所得到的重合成胰岛素晶体的活性与天然胰岛素一致。

天然胰岛素拆合实验的成功，给后续工作指明了方向。不必专门考虑二硫键的问题，只要分别合成A链和B链，就有办法得到具备完全活性的胰岛素。为了加强合成力量，中国科学院上海有机化学研究所和北京大学化学系等单位的科研人员也参加到研究工作中。然而，在当时浮夸、蛮干风气的影响下，一些领导和科学家认为合成胰岛素的关键科学问题已经解决，剩下的只是简单“堆肽”的技术工作。于是在各参研单位发动“大兵团作战”，用群众运动的形式来合成胰岛素，试图“用三十人一天干完原本一人三十天完成的事情”。可是，科学研究的基本规律不容违背，忽视“严格、严肃、严密”的治学精神必然不能得到扎实可靠的实验结果。在缴纳了高昂的“学费”后，1960年5月至7月的大兵团作战偃旗息鼓了。生化所、有机所和北京大学都只留下少数人员继续进行研究。

图1.1966年6月，中国科学院上海生物化学研究所、北京大学化学系、中国科学院上海有机化学研究所的科研人员在《科学通报》连续发表五篇论文，详细介绍了人工合成结晶胰岛素的成果。同年7月，美国《科学》杂志以《红色中国全合成胰岛素》为题对此进行了报道。

1963年，随着国民经济困难时期的结束，合成胰岛素的研究迎来了转机。在国家科委的协调下，生化所、有机所和北京大学三家单位又展开了通力合作。生化所负责B链合成，由钮经义和龚岳亭领导；有机所和北京大学共同合成A链（有机所负责C端十二肽，北京大学负责N端九肽），领导者是汪猷和邢其毅。1964年初，北京大学的一支精干队伍克服困难，进驻有机所工作。吸取了大兵团作战的教训，此时研究人员对数据的要求非常严格。在有机所，A链合成过程中每一步缩合产物都要“过五关、斩六将”，经过纸层析、电泳、旋光、酶解和元素分析的检验。本着“对的不一定对，不对的一定不对”的精神[1]，任何一项指标不合格，样品都要进行进一步纯化。到1965年夏天，胰岛素A链和B链的合成工作均已完成，也分别实现了与天然胰岛素B链和A链的组合。

图2.（上）人工合成的胰岛素晶体。（下）人工合成胰岛素进行活力测定实验的场景，图中右起依次为徐杰诚、杜雨苍、龚岳亭、施溥涛、张伟君。丨图片来源：中国科学院档案

1965年9月，人工合成A链和B链的组合实验在生化所进行，三家单位的研究人员汇聚在一起。17日清晨，他们目睹了自己为之奋斗了六年多的成果——立方体形、闪闪发光、晶莹剔透的全合成胰岛素晶体。在随后进行的生物测试中，把天然和人工合成的胰岛素分别注射入两组小鼠体内，结果两组小鼠都跳了起来（血糖降低引发的惊厥反应）。“那实在是一个无法用语言形容的激动人心的时刻。”三十多年以后，邹承鲁先生依然用饱含深情的语言回忆当时的情景。

在激烈的国际竞争中[2]，中国人第一个获得了人工胰岛素结晶！

1966年12月24日，《人民日报》头版头条刊登了《我国在世界上第一次人工合成结晶胰岛素》一文，并配发社论《用毛泽东思想打开“生命之谜”的大门》，高度赞扬了人工合成胰岛素的成就。1982年7月，中断了二十多年的国家自然科学奖重新开始评选。人工合成牛胰岛素研究项目获得国家自然科学奖一等奖。中国科学院上海生物化学研究所钮经义、龚岳亭（胰岛素B链合成）、邹承鲁、杜雨苍（天然胰岛素的拆合），北京大学季爱雪、邢其毅（胰岛素A链合成），中国科学院上海有机化学研究所汪猷、徐杰诚（胰岛素A链合成）八人被列为项目主要完成人。

“一旦功成千锤炼，不经意处百年愁”。汪猷先生的诗句道尽了科研工作者攀登科学高峰的执着与艰辛。

图3.左：C. B. Anfinsen（1916~1995），1972年诺贝尔化学奖获得者；右：R. B. Merrifield（1921~2006），1984年诺贝尔化学奖获得者。

在人工合成结晶胰岛素的工作中，天然胰岛素的拆合是最具原创性的部分。把暴露半胱氨酸巯基的胰岛素A链和B链置于碱性水溶液中，只需简单的空气氧化就能形成有活性的胰岛素。六个巯基在若干种可能的组合方式中，竟然能够正确配对，自动形成天然胰岛素结构所要求的三个二硫键。这充分论证了一个观点：蛋白质的高级结构可由其一维氨基酸序列确定。遗憾的是，由于不是合成胰岛素项目的主要目标，同时出于保密的考虑，这项成果当时没能及时发表。1961年，美国生物化学家安芬森（C. B. Anfinsen）报道了牛胰核糖核酸酶A[3]（RNase A）的失活与复性实验。用β-巯基乙醇将链内的每个二硫键还原为两个巯基，同时用高浓度的尿素破坏非共价相互作用，可使RNase A完全失活。而当去除β-巯基乙醇和尿素时，RNase A又自发地恢复了天然的活性与结构（二硫键重新正确连接）。据此，安芬森提出了后来以他的名字命名的法则：至少对于小型球状蛋白而言，其在生理条件下的天然结构由氨基酸序列完全决定。1972年，安芬森由于提出蛋白质折叠的基本原理获得诺贝尔化学奖。

至于胰岛素肽链的化学合成过程，应该说并没有突破费歇尔以来的合成范式，只是路线更长、连接的氨基酸数目更多、缩合条件的控制更加精细。1963年，美国生物化学家梅里菲尔德（R. B. Merrifield）发明了固相多肽合成法。该法将目标肽链C端的氨基酸共价结合在不溶解的树脂上，同时引入N-保护基（目前最常用的保护基是9-芴甲氧羰基），通过“去保护-偶联-洗涤”的循环操作朝N端逐个连接氨基酸，单次缩合的收率可达99%。随后，基于固相合成法的多肽自动合成仪被发明出来，使得长度在50个氨基酸以内的多肽合成变得十分方便。梅里菲尔德也因为在固相化学合成方面的贡献获得1984年诺贝尔化学奖。

随心所欲：重组DNA与生物制药新纪元

尽管人工合成蛋白质殊为不易，但是在自然界中蛋白质的形成无时无刻不在进行。根据分子生物学的“中心法则”：DNA是绝大多数生物的遗传物质，其中的遗传信息首先被转录为RNA，再被翻译成蛋白质。这套读取和执行遗传信息的精巧系统，是大自然亿万年演化的杰作。那么，是否可以让其为人所用，通过适当剪裁遗传信息、调用生物合成工具，按照人的意志和需求生产蛋白质呢？这个天方夜谭般的畅想，在20世纪70年代分子生物学技术爆发的浪潮中被迅速实现了。

图4.P. Berg（1926~2023），1980年诺贝尔化学奖获得者。

为这场技术革命奠基的一位标志性人物，是美国斯坦福大学的生物化学家伯格（P. Berg）。1972年，他在《美国国家科学院院刊》上发表了一篇划时代的论文，报道了一种在体外将来自不同物种的DNA片段共价重组的方法。伯格原本的研究目标，是把有明确功能的遗传信息片段导入哺乳动物细胞。为此，他选用猿猴病毒SV40的环状DNA分子作为“载体”，并以一段包含λ噬菌体基因及大肠杆菌半乳糖操纵子的DNA片段（简称λdvgal）作为“运输目标”。首先利用当时刚刚被发现的限制性内切酶在特定位点断开SV40的DNA，使之成为线性结构。再用末端转移酶在载体和目标DNA的3′-羟基末端分别延伸出一小段多聚脱氧腺苷酸[poly(dA)]和多聚脱氧胸苷酸[poly(dT)]。在适当的温度和盐度条件下，这两类“尾巴”通过A–T碱基互补配对发生“退火”，像拉链一样将载体和目标DNA分子暂时结合在一起。再用DNA聚合酶填补DNA链中的单链缺口、用DNA连接酶封闭磷酸二酯骨架上的单链切口，最终获得共价闭合的重组DNA分子。

伯格的重组DNA分子中融合了来自哺乳动物病毒、噬菌体和细菌的DNA片段，这标志着人类开始具备在体外有目的地拼接不同生物来源DNA片段的能力，他也因此获得了1980年诺贝尔化学奖[4]。正如《孟子·离娄下》所说，“人有不为也，而后可以有为”。伯格很快意识到重组DNA技术伴随着前所未有的生物安全风险与伦理问题。他并没有按照原定计划把SV40与λdvgal的重组DNA导入大肠杆菌。因为大肠杆菌能够在人体肠道内定植，而SV40可以在体外转化某些哺乳动物细胞（包括人类细胞），且在实验动物中具有明确的致瘤性[5]。1974年，伯格联合多位分子生物学家公开呼吁，主动暂停部分重组DNA实验，直至其风险得到充分评估。次年，他推动召开了著名的阿西洛马会议（Asilomar Conference），为制定重组DNA研究的安全规范奠定了基础。

图5.伯格的重组DNA实验原理图。此图展示的是将SV40的环状双链DNA分子切断，并将两分子线性双链DNA重组为一分子环状双链DNA的过程。其中包含了限制性酶切、链末端延伸、退火和聚合与连接等步骤。丨图片来源：Proc. Natl. Acad. Sci. USA1972, 69, 2904.

那么，重组DNA能否在细胞内复制并表达其中包含的遗传信息呢？美国加州大学旧金山分校的博耶（H. W. Boyer）和斯坦福大学的科恩（S. N. Cohen）对此给出了肯定的答案。博耶长期深耕限制性内切酶领域。限制性内切酶最早在细菌中发现，是细菌抵御噬菌体侵染、降解外源DNA的防御武器。博耶团队首次分离鉴定了著名的限制性内切酶EcoRI[6]。它可以特异性地切割双链DNA，并产生具备GAATTC型“回文”序列的黏性末端。两个相同的黏性末端可以依靠碱基互补配对自发进行退火连接（无需人工添加poly(dA)和poly(dT)尾巴），极大地简化了重组DNA的构建流程。科恩是质粒研究领域的权威学者。质粒是部分细菌胞内独立于染色体的小型环状双链DNA。科恩通过大肠杆菌转化实验分离得到的pSC101质粒仅有一处可被EcoRI切割的位点（SC是科恩姓名的缩写），同时自带四环素抗性基因，是理想的重组DNA载体（若菌株能够在含四环素的培养基中存活，则说明pSC101质粒成功进入细菌胞内，且表达了质粒中的基因）。1973年起，博耶和科恩合作开展重组DNA研究。他们借助EcoRI分别切割pSC101质粒与另一种具备卡那霉素抗性的R6-5质粒，并完成体外拼接。重组后的质粒被导入大肠杆菌胞内，使宿主菌株同时获得对四环素和卡那霉素的双重抗性。博耶和科恩意识到，他们不但发明了一种简单而通用的重组DNA技术，同时证实了人工构建的重组DNA可以在细菌宿主内稳定复制，并且正常表达外源遗传信息。

1976年1月的一个星期五，一位体格敦实、西装革履的不速之客敲开了博耶办公室的门。他名叫斯旺森（R. A. Swanson），时年28岁，是一名刚刚失业的风险投资经理。斯旺森此行的目的，是说服博耶与他共同创办一家公司，挖掘重组DNA技术的商业价值。博耶起初勉强同意给他10分钟时间介绍自己的想法，不料接下来两人却在学校附近的一家啤酒馆中畅聊了三个小时。彼时，重组DNA技术只是少数生物学实验室中的分子游戏。尽管很多人同意它在将来可能改变人类的生活，但毕竟也是几十年后的事情。然而这对资本市场的弄潮儿和掌握尖端技术的科学家决心突破常规，冒险一搏。他们各自出资500美元，成立了一家名为基因泰克（Genentech[7]）的公司，目标是利用重组DNA技术生产人胰岛素。五十多年来，作为药品的胰岛素全部从猪、牛等动物胰腺中提取。随着市场规模的不断扩大，动物胰岛素在价格和原料供应等方面的弊端逐渐显现。此外，猪、牛胰岛素的氨基酸序列与人胰岛素略有不同，早期动物胰岛素制剂还可能含有其他蛋白质杂质，因而更容易诱发抗体形成、过敏反应，并在少数患者中造成免疫介导的胰岛素抵抗。如果能借助重组DNA技术，将编码人胰岛素的基因导入大肠杆菌，利用生物发酵法大量生产人胰岛素，则必将改变这一局面，在造福广大患者的同时产生丰厚的经济回报。

图6.再现博耶（右）与斯旺森讨论创立基因泰克公司场景的雕塑，它坐落于美国旧金山基因泰克公司总部园区内。丨图片来源：https://www.gene.com/。

当时人们已经知道人体合成胰岛素的基本流程。在胰岛β细胞中，首先由相关基因转录并翻译产生前胰岛素原，切除信号肽后形成胰岛素原。这是一条单链多肽，包含胰岛素A链和B链的全部氨基酸序列，其间以另一个被称为C肽的肽段所连接（B–C–A）。在肽链完成折叠和形成所有二硫键后，由激素原转化酶切割B–C和C–A之间的连接位点，剥离C肽，进一步加工后得到成熟的胰岛素分子。然而编码胰岛素原的基因序列尚未被完全破解（当时还不清楚基因序列中存在不编码蛋白质的内含子），且原核生物没有合适的蛋白酶系统能对胰岛素原进行切割。因此无法基于胰岛素原的基因在大肠杆菌中直接表达胰岛素。经过艰苦的努力，基因泰克公司的科学家们解决了这个难题，在1978年打通了生产重组人胰岛素的技术路线。他们从人胰岛素A链和B链的氨基酸序列出发，根据基因密码子反推对应的核苷酸序列，用化学合成的方法得到两种DNA片段。由于胰岛素肽链的长度太短，为防止其在大肠杆菌中被降解，研究人员分别将上述两种DNA片段与编码β-半乳糖苷酶的全长基因一同重组到质粒中，再导入大肠杆菌进行复制和表达。最终在细菌提取液中用溴化氰将A链和B链从β-半乳糖苷酶的尾部切割下来，经体外氧化复性得到完整的人胰岛素。

基因泰克是历史上第一家由科学家和风险投资人合作成立的基因工程企业。公司草创之初，克服了政府监管、专利限制以及公众对基因技术的疑虑等多方面困难。并且开创了在没有任何成型产品的情况下，仅靠创新概念和未经验证的技术路线（“画大饼”）获得巨额融资的商业模式。在重组人胰岛素研发成功后不久，基因泰克与胰岛素行业巨头礼来公司签署合作协议。基因泰克提供重组人胰岛素的全套技术专利和工程菌株，礼来建设大规模发酵生产能力、负责临床试验与审批申报，并获得重组人胰岛素的全球独家商业化权利。基因泰克则享受里程碑付款、专利费和销售提成。1980年10月14日，成立刚满四年、仅有几十名员工的基因泰克在美国纳斯达克证交所上市，首次公开发行100万股，发行价每股35美元。开盘仅半小时股价就飙升至88美元，当日收盘于71.25美元，涨幅达103%。《洛杉矶时报》发出惊叹：“华尔街从未见过如此疯狂的交易！”1982年，礼来公司生产的重组人胰岛素注射剂（商品名“优泌林”，Humulin®）获得美国FDA批准，成为全球首款面市的重组DNA药物。它很快取代了传统的动物胰岛素制剂，成为守护无数糖尿病患者健康的常备药品。

图7.礼来公司生产销售的优泌林常规注射剂（浓度为每毫升100单位胰岛素）。图片来源：
https://americanhistory.si.edu/。

胰岛素分子的传奇就要告一段落了。围绕这个分子产生了太多值得书写和纪念的故事。从胰岛素概念的提出，到它的分离、结构表征与合成，串联起多次诺贝尔奖，完美地阐释了化学和生理医学基础研究对于解决人类健康问题的重大意义。今天，分子科学与分子医学正站在新的起点，我们期待着有更多像胰岛素一样改变世界的发现，帮助人类迈向更加美好的未来。

注释

[1] 指元素分析结果符合预期并不能保证所合成的肽段结构正确，而元素分析结果不符合预期则可以确认所合成的肽段结构一定不正确。

[2] 在同一时期，美国匹兹堡大学的卡佐亚尼斯（P. G. Katsoyannis）和联邦德国亚琛工业大学的查恩（H. Zahn）也在进行胰岛素合成研究。

[3] RNase A是一种能将RNA水解为小分子的单链多肽酶，含124个氨基酸，四个链内二硫键。

[4] 与桑格、伯格一同分享1980年诺贝尔化学奖的另一位科学家是美国人吉尔伯特（W. Gilbert）。他发明了利用化学降解测定DNA序列的方法。伯格获得奖金的一半，桑格和吉尔伯特各获得奖金的四分之一。

[5] SV40是否在人群中实际导致癌症，长期以来存在争议，多数流行病学研究并未确立明确的因果关系。

[6] 伯格最早用来切割SV40环状DNA的限制性内切酶是由博耶的实验室无偿提供的。

[7] Genentech是genetic engineering technology的缩写，意为基因工程技术。

参考文献

[1] F. Sanger, The chemistry of insulin. Nobel Lecture, 1958.

[2] D. C. Hodgkin,The X-ray analysis of complicated molecules. Nobel Lecture, 1964.

[3] V. K. McElheny, Science1966, 153, 281.

[4] Editorial of JAMA1968, 204, 1188.

[5] D. C. Hodgkin, Diabetes1972, 21, 1131.

[6] F. Sanger, Annu. Rev. Biochem.1988, 57, 1.

[7] R. Luft, Diabetologia1989, 32, 399.

[8] G. G. Brownlee, Biogr. Mems Fell. R. Soc.2015,61, 437.

[9] F. W. Lichtenthaler, Eur. J. Org. Chem.2002, 4095.

[10] A. O. W. Stretton, Genetics2002, 162, 527.

[11] A. de Leiva‑Hidalgo, A. de Leiva‑Pérez, Acta Diabetologica2023, 60, 163.

[12] M. Bliss, The Discovery of Insulin. University of Toronto Press, 1982.

[13] G. G. Brownlee, Fred Sanger - Double Nobel Laureate: A Biography. Cambridge University Press, 2014.

[14] G. F. Lewis, P. L. Brubaker, J. Clin. Invest.2021, 131, e142239.

[15] Jie Jack Li（美）著，邓卫平、游书力译，《药物考——发明之道》，华东理工大学出版社，2007年。

[16] 【英】乔治娜·费里著，王艳红、杜磊译，《为世界而生：霍奇金传》，世纪出版集团、上海科技教育出版社，2010年。

[17]【美】萨利·史密斯·休斯著，孙焕君译，马红武审译，《基因泰克：生物技术王国的匠心传奇》，中国人民大学出版社，2017年。

[18] 熊卫民，王克迪著，《合成一个蛋白质——结晶牛胰岛素的人工合成》，山东教育出版社，2005年。

[19] 杜严勇著，《胰岛素探秘者——张友尚传》，上海交通大学出版社、中国科学技术出版社，2015年。

致谢
作者感谢中国科学院上海有机化学研究所游书力院士、刘文研究员，复旦大学附属中山医院曹鑫研究员，中国科学院自然科学史研究所刘金岩研究员对本文的宝贵意见；感谢中国科学院上海有机化学研究所党政办公室蔡正骏、吴杲在档案查询方面的支持。

作者简介

郑超博士，中国科学院上海有机化学研究所研究员，国家自然科学基金委员会优秀青年科学基金项目获得者。研究方向为物理有机化学与手性合成。

版权说明：欢迎个人转发，任何形式的媒体或机构未经授权，不得转载和摘编。