Protein A不是一开始就有的：聊聊抗体纯化技术的前世今生

做抗体纯化的同行，每天打交道最多的就是Protein A亲和层析柱。但你有没有想过：在Protein A出现之前，我们是怎么纯化抗体的？为什么偏偏是Protein A成了金标准？从最早的硫酸铵沉淀到今天的连续层析，这一百年间到底发生了什么？

最近重读了《Process Scale Purification of Antibodies》第三版第二章——John Curling写的《抗体纯化技术的发展》。这一章把过去一百年的技术演进梳理得非常清楚，很多细节是平时做工艺开发不会特意去想的，但看完会有一种原来如此的感觉。

今天就把这一章的核心内容提炼出来，和大家聊聊抗体纯化技术这一百年是怎么走过来的。

一、前层析时代：从白喉抗毒素到硫酸铵沉淀

抗体纯化的历史，比很多人想象的要早得多。

1890年，Behring和Kitasato发现了白喉抗毒素——这是人类历史上第一次认识到血清中存在能中和毒素的物质。1894年，第一个治疗血清在美国上市，这也是历史上第一个生物药。

那时候没有层析，怎么纯化抗体？答案是沉淀法。

硫酸铵沉淀是最早被用的方法。1894年，Hofmeister发现了蛋白质溶解度和中性盐浓度的关系。后来Heidelberger和Kabat系统研究了用硫酸铵从山羊血清中沉淀破伤风抗体的方法——半饱和硫酸铵就能沉淀出大部分IgG。这套方法一直用到今天，实验室里还经常用。

Cohn乙醇分级法是二战期间发展起来的，主要用来从人血浆中大规模制备IVIG（静脉注射人免疫球蛋白）。这套方法通过控制乙醇浓度、pH、离子强度和温度，把血浆蛋白分成不同组分。组分II+III就是我们要的IgG。这个方法成本极低，适合大规模生产，直到现在IVIG生产还在沿用它的思路。

辛酸沉淀是后来发展出来的。1960年代，Steinbuch和Audran发现，在pH 4.8左右用辛酸可以沉淀掉大部分杂蛋白，而IgG留在上清里。这个方法的好处是：沉淀去除杂蛋白的效率很高，而且辛酸本身还能灭活脂包膜病毒。现在做IVIG的时候，辛酸沉淀还是一个常用的步骤。

不过这些沉淀法有个共同的问题：纯度不够。硫酸铵沉淀出来的IgG，纯度大概也就50-60%，离注射用的要求差得远。所以后来层析技术一出来，很快就把沉淀法挤到了辅助位置。

二、层析时代的黎明：从离子交换到羟基磷灰石

1950年代是层析技术的爆发期。

1950年，Tiselius因为发明吸附层析拿了诺贝尔化学奖。不过真正让层析走进实验室的，是后来的介质突破。

1959年，Porath和Flodin发明了Sephadex凝胶过滤介质——这是第一个商用的葡聚糖凝胶。紧接着1961年，聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Gel）也出来了。有了这些介质，按分子大小分离蛋白质才真正成为可能。

1960年代初，离子交换层析开始用在抗体纯化上。最早用的是DEAE-Sephadex（阴离子交换），后来又有了QAE-Sephadex。当时做IVIG的纯化流程是：先从Cohn组分II+III出发，用DEAE做一步阴离子交换，把IgG抓下来，再洗脱——这就是早期的离子交换捕获思路。

不过那时候的离子交换树脂有个很大的问题：溶胀收缩太厉害。干的树脂装柱之后，随缓冲液条件变化体积能变来变去，柱子很容易歪掉或者塌陷。为了解决这个问题，后来发展出了可控孔径的硬质介质，层析柱才真正稳定下来。

另一个早期常用的技术是羟基磷灰石（HAP）层析。1956年，Tiselius第一次描述了羟基磷灰石的层析行为。HAP的分离机理很特别——它不是靠电荷，也不是靠疏水，而是靠磷酸钙晶体和蛋白质之间的特殊相互作用。早期做单抗纯化的时候，HAP经常被用来做抛光步骤，去除聚集体和HCP。

不过说实话，在Protein A出现之前，抗体纯化的路线是很乱的。没有一个统一的捕获步骤，大家都是根据自己的经验组合离子交换、凝胶过滤、羟基磷灰石这些技术。有的用三四步层析，有的甚至用五六步，整个工艺又长又不稳定。

这种局面，直到1975年才被彻底改变。

三、1975年：Protein A改变了一切

1975年是个神奇的年份。这一年发生了两件大事：

第一，Kohler和Milstein发明了杂交瘤技术——单克隆抗体从此有了稳定的来源。

第二，Pharmacia推出了Protein A Sepharose——抗体纯化从此有了金标准。

Protein A本来是金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）细胞壁上的一种蛋白。1958年，Vevang第一次发现这种细菌能和人IgG结合。1962年，Forsgren和Sjöquist正式把它命名为Protein A。

那时候大家还不知道Protein A到底长什么样。直到1970年代，Uppsala大学的团队才把它的结构搞清楚：Protein A有5个同源的IgG结合结构域（E、D、A、B、C），每个结构域大概58个氨基酸，专门结合IgG的Fc段。这种结合是可逆的——中性条件下结合，低pH条件下洗脱。

这个特性太适合做纯化了。直接把Protein A固定在层析介质上，细胞培养上清过一遍，抗体就被特异性抓下来了，杂质全部流穿。一步捕获，纯度直接从百分之几跳到95%以上。

Pharmacia反应很快，1975年就推出了第一个商用的Protein A亲和柱——Protein A Sepharose CL-4B。从那以后，单抗纯化的整个逻辑都变了：第一步一定是Protein A捕获，后面再跟两步抛光。

但早期的Protein A有个问题：它是从金黄色葡萄球菌里直接提取的天然蛋白。产量低、成本高、批间差异大，而且耐碱性差——CIP清洗用的0.1M NaOH没过几个循环就失活了。

这个问题后来靠重组Protein A配基解决了。1980年代，基因工程技术成熟了，大家开始用大肠杆菌表达重组的Protein A结构域。通过基因改造，可以让配基更耐碱、结合容量更高、非特异性吸附更低。

到今天，Protein A配基已经发展了好几代：从最早的天然提取，到重组单结构域，再到现在的耐碱、高载量、低脱落的工程化配基。GE、Thermo、MabPhrase这些厂家的Protein A柱，动态载量能做到50-60g/L，寿命能到100-200个循环。

成本也在一路下降。早期Protein A树脂是按毫升卖的，一升几千美元。现在规模化生产之后，抗体每克的Protein A层析成本已经从早年的几十美元降到了现在的几美元。

四、平台化时代：从三柱到两柱的演进

Protein A成为捕获步骤之后，单抗纯化的基本框架就定下来了：

细胞培养收获 → 离心/深层过滤澄清 → Protein A捕获 → 低pH病毒灭活 → 第一步抛光（CEX或AEX） → 第二步抛光（HIC或混合模式） → 病毒过滤 → UF/DF → 制剂

这套经典三柱工艺用了二十多年。但为什么是三柱？不是两柱？也不是四柱？

答案很现实：因为早期的树脂性能不够好。

Protein A捕获之后，上清里还有HCP、DNA、聚集体、浸出Protein A这些杂质。一步抛光搞不定，得分两步：第一步用阳离子交换（CEX）抓聚集体和HCP，第二步用阴离子交换（AEX）流穿模式去HCP、DNA和病毒。两步抛光各有分工，加起来才能达到制剂级的纯度。

但随着树脂技术进步，情况慢慢变了。

混合模式层析的出现，让单步抛光的能力大幅提升。Capto Adhere、Capto MMC这些混合模式介质，同时有电荷和疏水两种相互作用，一步就能去掉HCP、聚集体、DNA好几种杂质。很多新的工艺已经开始用两柱：Protein A + 一步混合模式抛光，就够了。

膜层析是另一个方向。传统的树脂层析，传质靠扩散，流速上不去，处理大体积料液的时候很慢。膜层析的孔径大，传质靠对流，流速能快好几倍，特别适合做AEX流穿抛光和病毒去除。现在很多新建的产线，抛光步骤已经用膜替代树脂了。

还有一个趋势是预组装柱（Disposable Pre-packed Column）。以前做工艺开发要自己装柱，装柱好坏直接影响分离效果，特别考验手感。现在好了，厂家直接把柱子装好、验证好，拿来就用。临床批次小的时候，用一次性柱既省时间又省验证成本。

从三柱到两柱，看起来只是少了一步，但背后是树脂性能、膜技术和工艺设计理念的整体进步。

五、下一个十年：连续层析和连续制造

如果说过去五十年的主线是Protein A加平台工艺，那接下来十年的关键词就是连续制造。

为什么要做连续？因为传统的批次生产有个天生的问题：设备利用率低。一个批次从开始到结束，柱子装了拆、拆了装，真正在跑料的时间其实没多少。而且批次越大，Validation和质量控制的复杂度越高。

连续层析（Periodic Counter-current Chromatography, PCC）的思路是：用好几根小柱子，按时间差交替运行，前一根在上样的时候，后一根在洗脱、再生、平衡，料液不停，柱子轮转。这样一来，同样的总树脂体积，处理量能翻好几倍，柱子利用率从30%提到70%以上。

诺华和MIT合作做的连续制造项目，已经验证了整套端到端的连续生产：从细胞培养到制剂，全封闭、全连续、自动化。产线规模不大，但年产能不输传统的大批次工厂。

当然，连续制造也不是万能药。它对自动化控制、数据系统、供应链稳定性的要求高得多，验证的逻辑也和批次生产完全不一样。目前真正在商业化生产线上用连续层析的单抗产品还不多，但技术已经成熟了，就看什么时候大规模铺开。

除了连续层析，还有几个方向也值得关注：

-沉淀法回潮：辛酸沉淀、PEG沉淀这些老技术，现在又被重新捡起来研究，作为Protein A的替代方案。毕竟Protein A树脂太贵了，如果能用便宜的沉淀法替代一部分，成本能降一大截。

-多模式层析（MMC）：一根柱子上同时实现捕获和抛光，进一步缩短流程。

-模拟移动床（SMB）：工业上早就用在小分子分离了，现在慢慢往生物大分子迁移。

六、写在最后：技术演进背后的逻辑

看完这一百年的发展史，有几个感触特别深：

第一，没有永恒的金标准，只有不断迭代的最优解。硫酸铵沉淀曾经是唯一的选择，后来被层析替代；离子交换曾经是捕获主力，后来被Protein A取代；Protein A现在是金标准，但未来也可能被连续层析或者其他技术部分替代。技术永远在进化，做工艺的人不能抱着一套方法吃一辈子。

第二，成本永远是核心驱动力。从早期的四五步层析，到现在的两柱工艺，再到现在研究连续层析和沉淀法替代，背后都是成本。为什么Protein A这么贵还要用？因为它一步就能搞定捕获，省下来的时间和人力比树脂钱划算。未来什么技术能起来，不看它多先进，看它能不能在保证质量的前提下把成本降下来。

第三，平台化是行业成熟的标志。早期每个抗体都要从头开发工艺，现在大部分IgG都能用同一套平台流程。这背后是介质性能的提升、工艺理解的加深，也是行业积累的结果。但平台化也不是终点——双抗、ADC、IgM这些复杂分子出来之后，平台又要重新设计了。

做抗体纯化这行，看起来每天都是在调柱子、摸条件，但往回看一百年，每一步技术迭代都不是偶然的。知道我们从哪里来，才更清楚要往哪里去。

这本书的第二章，非常推荐做下游工艺的同行认真读一遍。不是要记住那些年份和人名，而是理解每一项技术为什么会出现、为什么会被替代，背后的逻辑是什么。

本文基于《Process Scale Purification of Antibodies》第三版第二章《The Development of Antibody Purification Technologies》（作者：John Curling）内容提炼整理。

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