水凝胶保护衣登上《Nature BME》！

给胰岛细胞穿上 20 μm“水凝胶保护衣”，糖尿病小鼠血糖正常超100天

胰岛移植被认为是治疗1型糖尿病极具潜力的细胞疗法之一，但一个核心难题始终没有解决：如何让移植后的胰岛既能获得足够的氧气和营养、快速感知血糖并释放胰岛素，又能逃避免疫系统的攻击？传统策略通常将胰岛包裹在毫米级水凝胶微囊中，“壳”越厚，免疫隔离能力往往越强，但随之而来的却是传质变慢、移植体积急剧增加，甚至出现大量没有装载细胞的空胶囊。相反，几百微米甚至更薄的包膜虽然传质更好，却往往无法提供长期免疫保护。如何在“薄”和“保护力强”之间找到平衡，成为细胞封装领域长期面临的挑战。

近日，宾夕法尼亚州立大学王勇教授团队从哺乳动物卵细胞的透明带中获得灵感，提出了一种仿生透明带（biomimetic zona pellucida，BZP）细胞封装策略。研究人员利用适配体介导的分子识别，将凝血酶定位在细胞表面，并进一步触发纤维蛋白原组装、海藻酸盐交联和聚赖氨酸固化，在细胞表面“原位长出”一层厚度仅约20 μm的水凝胶保护壳。整个过程无需微流控设备、无需液滴生成，并在接近生理条件的水相环境中完成，细胞封装效率达到100%。更重要的是，接受BZP包裹胰岛移植的免疫健全糖尿病小鼠能够恢复正常血糖，多数动物维持约100天，其中部分超过100天，为细胞免疫隔离提供了一条与传统“大胶囊”截然不同的技术路线。相关成果以“Biomimetic zona pellucida-encapsulated islets for sustained glycaemic control in immunocompetent mice”为题发表在《Nature Biomedical Engineering》上。

天然卵细胞已经给出了一个看似“反直觉”的答案：保护层不一定越厚越好。成熟人卵细胞外侧的透明带通常只有10—30 μm，却能够承担重要的机械保护和分子屏障功能。受精发生后，Ca²⁺及相关酶促反应会迅速诱导透明带中的糖蛋白发生剪切、组装与交联，使原本柔软的结构迅速“硬化”。研究团队将这一过程拆解成三个步骤，再搬到了人工细胞封装体系中（图1a）：首先利用插入细胞膜的DNA适配体捕获并固定凝血酶；随后凝血酶在Ca²⁺存在下催化纤维蛋白原转化为纤维蛋白网络；最后再引入海藻酸盐和聚赖氨酸，通过多重交联进一步加固这一保护层。这一设计能否真正运行，关键首先在于凝血酶能不能被“拴”在细胞表面，同时继续保持活性。研究人员筛选了三种凝血酶适配体，发现它们都具有结合能力，但对酶活性的影响并不相同，其中Apt-2和Apt-3仍能保留较高的蛋白水解活性（图1b）。在微粒模型上，适配体可以稳定捕获荧光标记凝血酶（图1c），其表面滞留半衰期约为180 min（图1d）。这相当于先在细胞表面安装了一层“分子催化站”，让后续材料只在目标表面发生组装，而不是在整个溶液中随机成胶。随后，凝血酶触发纤维蛋白原快速形成具有纤维网络结构的纤维蛋白水凝胶（图1e）。这种多孔网络为海藻酸盐进一步渗入提供了空间。海藻酸盐进入后，一方面与纤维蛋白之间发生化学交联，另一方面又通过羧酸基与Ca²⁺形成离子交联，并继续与带正电的聚赖氨酸形成聚电解质复合。最终，三种不同作用共同将原本疏松的纤维网络“锁紧”，形成更加致密稳定的Fb–alginate–polylysine复合结构（图1f）。值得注意的是，这些步骤都在水溶液中完成，没有低pH、有机溶剂、自由基或强剪切等可能损伤细胞的条件。

图1：仿生透明带BZP的形成机制。

有了这套表面原位组装机制，下一个问题是：形成的“壳”到底均不均匀？图2给出了非常直观的答案。研究人员首先在微粒上构筑BZP，从球体中心分别沿0°、45°和90°方向读取荧光强度，三个方向得到几乎相同的信号分布，说明保护层沿整个周向形成得十分均一（图2a）。进一步通过x–y、y–z和x–z三个方向的共聚焦成像及三维Z-stack重构，可以看到BZP完整地包覆在微粒表面，而不是局部堆积（图2b）。更重要的是，这一策略并不依赖规则的人工颗粒。研究人员进一步将其应用于间充质干细胞和MCF7细胞构成的同型细胞球（图2c），以及MSC、MDA-MB231:3T3组成的异型细胞球（图2d），均成功获得完整包覆。形成的BZP平均厚度约20 μm，与成熟人卵细胞透明带处于相近尺度。即使将多个细胞球融合成人为构造的不规则结构，或者直接使用天然组成复杂的胰岛，BZP仍然能够沿其外表面形成，说明这种方法对细胞类型、尺寸和几何形状具有较好的适应性。

图2：BZP在不同颗粒和细胞表面的均匀包覆。

“壳”做得薄，还必须同时做到“该进的能进，该挡的能挡”。研究人员使用不同分子量的FITC-葡聚糖考察BZP的分子通透性（图3a）。结果显示，4 kDa小分子可以较自由地通过保护层，而随着分子量增加，通透性逐渐下降，到250 kDa时已经基本无法穿透。这意味着BZP并不是一个简单的致密塑料袋，而更像一层具有尺寸筛分能力的半透膜：小分子营养物和代谢相关分子能够交换，而大分子则受到明显阻挡。抗体结合实验也进一步证明，BZP可以显著减少大分子抗体接触细胞表面。这层20 μm薄膜还表现出了明显的机械保护作用。未包覆的MSC细胞球在培养板上会逐渐黏附、铺展，而BZP包裹后的细胞球在72 h后仍保持原有形态（图3b）；经过剧烈涡旋处理后，裸细胞球几乎完全解体，而包覆后的细胞球依然保持完整（图3c）。更关键的是，保护层并没有以牺牲细胞活性为代价。活/死染色、ATP和代谢活性测试均显示，包覆前后细胞活力没有显著差异（图3d）；VEGF分泌同样基本不受影响（图3e），表明这种温和的原位组装过程能够在“加壳”的同时保留细胞正常功能。

图3：BZP的选择性传质、生物相容性及机械保护作用。

真正的考验来自体内。研究人员首先将大鼠胰岛进行BZP包覆，可以看到处理后胰岛依然保持很高的细胞活性（图4a）。葡萄糖刺激胰岛素分泌实验也显示，裸胰岛和BZP包裹胰岛面对高糖刺激时均能正常释放胰岛素，两组刺激指数分别约为4.6和4.3，没有显著差异（图4b）。也就是说，这层水凝胶既没有“闷住”胰岛，也没有明显削弱其感知葡萄糖、释放胰岛素的核心功能。随后，团队将大鼠胰岛移植到免疫健全的糖尿病小鼠腹腔中（图4c）。移植20天后的腹腔葡萄糖耐量测试显示，与糖尿病组和裸胰岛组相比，BZP组能够更快清除血液中的葡萄糖，其血糖恢复水平已经接近健康小鼠（图4d、e）；同时，葡萄糖刺激后血清大鼠C肽明显升高，证明移植胰岛仍在体内持续发挥功能（图4f）。长期监测结果更加关键：裸胰岛组血糖很快重新升高，而BZP组在移植后约第6天即可将血糖降低到200 mg dl⁻¹以下（图4g），整体60天血糖负荷也明显降低（图4h）。约80%的小鼠可以维持正常血糖至66天，部分动物维持至84天和87天，甚至有一只超过100天（图4i）。

图4：BZP包裹胰岛在糖尿病小鼠中的体内降糖效果。

不过，研究团队并没有忽视材料长期植入后的异物反应。普通海藻酸盐虽然在体内相对稳定，但仍可能吸附蛋白并诱发炎症和纤维化。因此，他们进一步采用两性离子修饰的超纯海藻酸盐构建升级版BZP-U。与普通海藻酸盐构建的BZP-R相比，BZP-U显著减少了蛋白吸附，并降低了与异物反应相关的炎症信号。随后，研究人员进行了更加严格的同种异体小鼠胰岛移植实验。移植40天后，BZP-U组小鼠的葡萄糖清除速度明显快于BZP-R组（图5a），葡萄糖耐量曲线下面积显著降低（图5b）。葡萄糖刺激后，两组都能检测到升高的小鼠C肽，证明移植胰岛依然具有分泌功能，而BZP-U组表现更加突出（图5c）。长期观察中，BZP-R组小鼠从约48天开始陆续重新出现高血糖，而BZP-U组7只小鼠中仅1只在63天左右出现高血糖，其余6只维持正常血糖约100天，其中5只超过100天（图5d）。这一结果表明，除了“做薄”，如何控制材料表面蛋白吸附和宿主异物反应，同样是实现长期细胞保护的关键。

图5：两性离子超纯海藻酸盐进一步提升长期移植效果。

小结

总体来看，这项研究最值得关注的地方，并不仅仅是把水凝胶胶囊从毫米尺度缩小到了20 μm，而是改变了传统细胞封装的设计逻辑：与其先制造一个胶囊再把细胞装进去，不如让保护层直接在细胞表面按照分子识别—触发组装—多重交联的方式原位生长。与500 μm微囊相比，对于100 μm左右的细胞团，20 μm BZP所需聚合物体积仅约为前者的1/71；同时，其无设备、无液滴和100%包覆的特点，也有望避免传统微囊制备过程中空胶囊和尺寸不均等问题。当然，目前结果仍主要来自小鼠实验，长期免疫反应、材料稳定性以及在大型动物中的安全性和有效性仍需进一步验证。但这种从天然透明带获得灵感的“超薄而强韧”保护策略，为供体胰岛以及干细胞来源β细胞的免疫隔离提供了新的可能，也为再生医学、细胞治疗和仿生材料设计打开了新的想象空间。